脂质体体外溶出检测：两步反向透析

简介

近年来，微球、脂质体、纳米制剂等新型给药技术得到了广泛的关注，尤其是脂质体，被认为可用于不同的活性物质，包括水溶性/水不溶性小分子、核酸以及蛋白质。脂质体制剂可改变药物原有的体内分布特性，从而获得更高的治疗效力，降低毒性，但同时也在一定程度上改变了产品的质量或性能，可能导致严重的危害。

建立合适的体外溶出检测技术，对于准确控制药物性能规格是非常关键的步骤，其难点是需确保其与体内释放特性一致，此外，鉴于应用领域的差异，如抗肿瘤、抗病毒和抗真菌治疗、持续性给药或用于基因递送的非病毒载体，可能需要不同的检测方法。对于持续性给药，需要针对缓释的检测技术，而对于靶向给药，检测技术需能验证在到达靶标前没有药物释放。

本实验以替诺福韦的脂质体制剂为样品，测试了透析和反向透析在体外溶出检测中的可行性。被动靶向脂质体在体内的分布过程包括两个阶段：1）到达靶标前的运输过程，此时药物小分子被截留在脂质体内部；2）达到靶标后的药物诱导性释放。所以，体外检测技术除需辨别不同制剂释放特性外，还需“真实”模拟这两个阶段。

实验

替诺福韦脂质体制备，并测试替诺福韦膜扩散特性。以溶出介质（HEPES缓冲液）制备1mg/ml替诺福韦标准溶液，取0.5ml标准溶液加入50kD Float-A-Lyzer G2纤维素酯透析膜管，将膜管放入50ml的溶出介质中，在37℃条件下以10 rpm搅拌透析。以预先设定的时间间隔从介质中取样1ml，通HPLC确定药物溶出量。同时测试不同表面活性剂对扩散特性的影响，包括SDS、SDS与Triton X-100混合液。

透析及反向透析操作步骤

透析

进行透析操作时，将脂质体制剂置于透析膜管内，然后将透析膜管置于充满释放介质的透析容器内，于37℃条件下，以100rpm的速度进行搅拌。以特定的时间间隔从外部溶液内取样检测。测试包括两个阶段：

阶段1：向透析膜管内加入0.3ml脂质体样品，放入含有30ml溶出介质的透析容器内。在2h和24h时，从外部溶液中取出1ml样品进行检测。

阶段2：测试进行到24h时，向每个透析管内加入0.3 ml的HEPES缓冲液（含2% SDS和2% Triton X-100），获得0.6ml的混合液。同时，将30ml含有SDS和 Triton X-100的HEPES缓冲液加入到外部溶液，获得60ml溶出介质。从外部溶液按特定时间间隔取1ml样品检测。

反向透析

进行反向透析操作时，将1ml溶出介质加入透析膜管，然后放入含有70ml溶出介质的透析容器内，于37℃，以100rpm的速度搅拌。脂质体加入外部溶液。以特定的时间间隔，从透析膜管内部取1ml样品进行检测。为模拟脂质体体内释放特性，使用2步溶出测试法：

阶段1：将0.4ml脂质体加入外部溶液（70ml）。在4和24h时，从透析膜管内取1ml样品检测。

阶段2：测试进行到24h时，向外部溶液加入10ml的HEPES缓冲液（含4% Triton X-100），获得80ml的溶液。按特定时间间隔，从透析膜管内取1ml样品检测。

结果

替诺福韦膜扩散特性：  如不采用表面活性剂处理，90%的药物穿过透析膜需要较长时间（~7h），处理后，扩散速率可极大提高。而对于膜MWCO，50kD膜扩散速率显著高于20kD膜，但进一步增加MWCO则无显著变化。

透析：第一阶段结束时（24h），只检测到小部分药物（~3%），这部分药物为游离药物。在第二阶段，向外部溶液添加表面活性剂后，药物开始从透析膜管内部释放扩散。但在添加表面活性剂后的初始阶段，释放量会有“爆发性”变化，且溶出过程耗时较长（90%药物溶出约需5天），所以传统透析方法不完全适合这种类型的测试研究。

反向透析：在溶出测试的第一阶段，可于4h后检测到~4%的药物，且直到24h时，几乎保持恒定。这部分药物为游离药物。一般情况下，游离药物百分率低于5%，即可认为制剂合格，如超过该标准，则需进行进一步纯化，以去除过量的游离药物，然后再进行溶出研究。

在溶出测试的第二阶段，添加表面活性剂后，脂质体开始溶出药物，并在约48h后完成。为比较不同剂型的溶出特性，将24h和72h的数据分别标准化为0%和100%。实验选用了含有DMPC、DPPC、DSPC和SA的四种脂质体剂型，以代表具有不同溶出特性的脂质体。结果证明，反向透析方法对于不同脂质体剂型的释放特性具有良好的分辨力，可用于质量控制测试。

Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 即用型透析装置操作方法

总结

膜扩散方法是一种较为简单和理想的分离技术，一般不会影响载体和药物的解离特性，有助于阐释药物溶出和扩散通过透析膜的过程，以方便从整体上理解药物从脂质体溶出的特性，与常规透析方法相比，反向透析显著降低了速率变异性，同时可有效辨别不同的剂型，以用于质量控制测试。

在体外37℃条件下，结合使用pH 7.4的HEPES缓冲液（阶段1）和含1% Triton X-100的HEPES缓冲液（阶段2），成功模拟了药物体内分布的两个阶段：循环过程无药物释放以及在靶标位置的诱导性药物释放，以对复杂的药物输送系统进行研究。

参考文献：Xu, X., Khan, M.A., Burgess, D. J., A two-stage reverse dialysis in vitro dissolution testingmethod for passive targeted liposomes. Pharmaceutical nanotechnology. 2012,426: 211-218.

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