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重组AAV的大规模纯化

重组腺相关病毒(rAAV)是一种非常有吸引力的工具,已作为通用的基因递送载体,用于基因治疗。尽管rAAV可安全地将治疗性基因转移至体内分裂或非分裂的细胞,但rAAV生产的传统方法面临着诸多挑战。为了将载体有效地用于体内基因转导,rAAV终产物需含有最低限度的杂质及空颗粒。基于此,需要适于大规模生产的、简单的纯化工艺。但是从转染的人胚胎肾源性293(HEK293)细胞的细胞裂解液中收获和纯化rAAV的传统方法往往涉及多个繁琐的步骤,且使用氯化铯(CsCl)或碘二甲醇密度梯度超速离心的方法不适于大规模生产。所以要开发替代方法,以将rAAV用于临床实践。

 

基于过滤和层析的技术路线可规模放大。已有诸多类似纯化方案的报导,大多数使用离子交换和亲和层析。亲和层析技术较难从空颗粒中分离病毒基因组的颗粒。而由于在有或没有载体基因组存在的条件下,病毒颗粒(衣壳蛋白)的等电点会有不同,所以,离子交换层析是一种有效的替代方法。之前有报导,使用双离子交换层析柱配置(阳离子/阴离子交换)层析,可有效地分离病毒基因组颗粒。此外,基于rAAV血清型1(rAAV1)的分子粒径,还可使用体积排阻层析(凝胶过滤)。

 

相比其它血清型,rAAV1可更有效地转导骨骼肌,被认为是非常有前景的治疗性载体。此外,第一个获批的基于rAAV的药物,Glybera ,即以rAAV1生产。在此研究中,科研人员尝试使用过滤和层析方法(双离子交换和凝胶过滤层析),从无血清培养上清液中生产和纯化rAAV1,以避免超速离心纯化相关的缺陷。


不含超速离心步骤的重组腺相关病毒血清型1(rAAV1)生产和纯化程序。三个质粒(cis-AAV质粒(带AAV-2型反向终端重复子)、trans-质粒(带AAV-2型Rep基因和1型Cap基因)及腺病毒辅助质粒(带腺病毒基因组的基本区域))使用PEI转染至无血清培养基中的HEK293细胞。转染120hr后,收获培养上清液,以0.45μm过滤器过滤。之后,使用配有中空纤维柱的KrosFlo Research IIi 切向流过滤系统进行切向流超滤并浓缩10倍。使用1/3-饱和的硫酸铵(AS)沉淀,降低蛋白质碎片的含量,rAAV1最终沉淀于1/2饱和的AS溶液中(1/3→1/2 AS)。然后在低盐缓冲液(含5mmol/L NaCl)中透析,并吸附至离子交换膜。最后,从阴离子交换柱上洗脱的rAAV1用凝胶过滤层析纯化(T.Tomono, et al., 2016)。


对获得的终产物进行分析,结果显示,纯化的rAAV1在SDS-PAGE中呈现3根清楚的条带(81.4kD的VP1、66.2kD的VP2和59.6kD的VP3),而根据负染电镜分析,90%的rAAV1含有完全包装的病毒基因组。从4x10^9HEK293细胞获得的纯化rAAV1基因组滴度为3.63x10^13v.g./ml。 


rAAV1终产物以5-20%梯度SDS-PAGE凝胶(左)、Western Blotting(中)及电镜分析(T.Tomono, et al., 2016)。


这种新的方法生产了高纯度的载体,使用化学限定培养基、TFF和膜层析等技术,可支持工艺的放大,并确保安全的临床研究。这种适用于分泌至无血清培养基的rAAV1的纯化方法,适用于分泌至悬浮培养系统中无血清培养基的rAAV1。静脉注射时,CsCl对小鼠的LD50为910μg/g,所以,无CsCl、无超离的方法从毒性角度考虑,更加安全,更适于rAAV1的临床使用。这种“流线型”纯化方案有助于未来的临床研究。


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本文节选自以下文章,因水平有限,如有不当之处,敬请谅解。完整的详细内容,请参考原文。


参考原文:

  • T.Tomono, Y.Hirai, H.Okada, et al., Ulrecentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1(rAAV1). Molecular Therapy - Methold & Clinical Development, 2016, 3:15058.

  • M.Penaud-Budloo, A.Fracncois, N.Clement, et al., Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production. Molecular Therapy: Methods & Clinical Developemt, 2018, 8: 166-180.





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