纳米医药中的切向流过滤应用案例

来自美国国家癌症研究所等的科学家们在2018年第7期的《Journal of Extracellular Vesicles》杂志上发表了题为“Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes”的文章。

文中，使用切向流过滤（TFF）从澄清的条件培养基中纯化细胞外囊泡（EV），去除非EV成分，并进行浓缩。对于小规模实验，使用手动注射器操作的方法，以等体积洗滤和浓缩模式进行，比较不同MWCO的MicroKros中空纤维组件：750kD和0.05μm。对于稍大规模实验，使用0.05μm孔径的MidiKros聚砜中空纤维组件结合蠕动泵系统操作。结果显示，TFF可有效去除非EV成分，并对其进行有效浓缩，以进行后续的体积排阻层析（SEC）处理。

摘要：细胞外囊泡（EV）在治疗性应用上的开发依赖于临床级囊泡可重复、可放大且高通量的生产和纯化方法的建立。包括超速离心（U/C）、超滤、免疫沉淀以及体积排阻层析（SEC）等的方法已被用于EV的分离，但每种方法都面临效率、颗粒纯度、处理时间过长和/或样品处理量等方面的限制。我们开发了一种用于EV可放大的生产、浓缩和分离、且符合cGMP要求的方法，该方法策略性地结合了生物反应器培养、切向流过滤（TFF）以及制备型SEC。我们使用这种方法成功分离了载有新型人免疫刺激细胞因子融合蛋白、异二聚体IL-15（hetIL-15）/乳凝集素复合物的工程EV。稳定表达融合细胞因子的HEK293细胞培养于中空纤维生物反应器。收集条件培养基，分离EV，并比较了三种程序：U/C、SEC或TFF+SEC。SEC被证实可获得与U/C纯化相当的颗粒回收、粒径分布以及hetIL-15密度。相比U/C，SEC可达到100倍的铁蛋白浓度降低，后者是一种主要的蛋白质-复合物污染物。比较蛋白质组学显示，SEC可额外降低与EV不相关的细胞质蛋白的丰度。将TFF和SEC相结合，可用于起始大体积料液的处理，获得具有生物活性的EV，且不会造成颗粒产量的明显损失或影响粒径、形态和hetIL-15/乳凝集素密度。综上所述，将生物反应器培养与TFF+SEC方法相结合可获得一种可放大且高效的方法，用于生产高纯度、具有生物活性的载hetIL-15/乳凝集素的EV生产，这在靶向肿瘤免疫治疗方法开发中将会是非常有用的工具。

原文：D.C.Watson, B.C.Yung, C.Bergamaschi, et al., Scalable, cGMP - compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles, 2018, 7:1442088.

来自意大利帕威亚大学等的科学家们在2018年第7期的《Cells》杂志上发表了题为“Pilot Production of Mesenchymal Stem/Stromal Freeze-Dried Secretome for Cell-Free Regenerative Nanomedicine: A Validated GMP-Compliant Process”的文章。

文中，在进行间充质干细胞/基质细胞（MSC）分泌物纯化时，先对细胞培养后的条件培养基进行离心，去除细胞碎片和凋亡小体，然后收集上清液，使用配有5kD中空纤维组件的KrosFlo Research 2i系统进行MSC-分泌物的切向流过滤纯化。使用前，仪器的所有部件灭菌，超滤在B级洁净室中层流罩的无菌条件下，以自动化工艺模式进行，样品先浓缩，再洗滤，剪切维持在2000S-1– 6000S-1，跨膜压不超过5psi。浓度达到0.5x10^6cells/mL时，停止浓缩步骤，接着以无菌超纯水进行洗滤。

冻干间充质干细胞/基质细胞分泌物生产工艺（E.Bari, et al., 2018）。

摘要：本文介绍了一种在经验证的、符合GMP要求的细胞工厂中，用于间充质干/基质细胞冻干分泌物的中试级生产工艺。分泌物通过超滤从培养上清液中纯化，加入冷冻保护剂，冻干并鉴定。我们获得了一种含有细胞外囊泡和蛋白质的冻干、即用且可溶性的粉末。使用纳米颗粒示踪分析，检测冻干产品中未聚集的细胞外囊泡群落；傅里叶红外变换光谱显示同时存在蛋白质和脂质，而示差扫描量热法显示冻干工艺成功进行。蛋白质组学特征可用于鉴定参与免疫反应、应激应答、细胞骨架和代谢的蛋白质。此外，浓度达25mg/mL时，产品无细胞毒性（MTT法分析了人成纤维细胞、软骨细胞和髓核细胞），且在达150mg/mL时，血液相容。最后，在5-50mg/mL浓度下，经MTT分析显示，冻干的分泌物于体外可对抗H2O2诱导的髓核细胞的氧化应激损伤。

原文：E.Bari, S.Perteghella, D.D.Silvestre, Pilot Production of Mesenchymal Stem/Stromal Freeze-Dried Secretome for Cell-Free Regenerative Nanomedicine: A Validated GMP-Compliant Process. Cells, 2018, 7, 190; doi:10.3390/cells7110190.

来自英国伦敦大学学院的科学家们在2017年的《The Journal of Immunology》杂志发表了题为“Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery”的文章。

文中，使用配有孔径0.05μm中空纤维过滤器组件的KrosFlo Research IIi切向流过滤系统结合差速离心，对制备的聚合物囊泡进行粒径分馏，以获得所需尺寸的产物。

摘要：中性粒细胞是炎症反应中的关键效应细胞，在中和入侵的病原体中发挥重要作用。在炎症消退过程中，中性粒细胞在被巨噬细胞清除前发生凋亡，但如果细胞凋亡延迟，中性粒细胞可引起广泛的组织损伤和慢性疾病。促进中性粒细胞凋亡是治疗持续性炎症的一种潜在治疗方法，但是中性粒细胞是很难进行实验操作的细胞。在本研究中，我们使用生物相容、纳米尺寸的合成性囊泡或聚合物囊泡，将治疗性化合物递送至中性粒细胞，其可通过与清道夫受体的结合而内化，然后通过一种pH-触发的分解机制而躲避早期核内体。这使得聚合物囊泡可将分子递送至中性粒细胞的细胞溶质，而不引起细胞活化。对聚合物囊泡大小进行优化后，我们发现，在体外，聚合物囊泡可将细胞循环依赖性激酶抑制剂（R）-罗斯科维汀导入人中性粒细胞，而促进凋亡。最后，使用转基因斑马鱼模型，我们发现包封的罗斯科维汀相比游离的药物，可在体内更快地加速炎症消退。这些结果证实，聚合物囊泡是有效的细胞内载体，可将药物递送进中性粒细胞。这对中性粒细胞生物学的研究以及靶向中性粒细胞的治疗药物的开发有重要的意义。

原文：J.D.Robertson, J.R.Ward, M.Avila-Olias, et al., Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. The Journal of Immunology, 2017, doi:10.4049/jimmunol.1601901.

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