灌流中，ATF平均剪切低于TFF：低剪切提高重组蛋白生产，高剪切增加细胞凋亡
来自瑞典KTH和英国阿斯利康等的研究人员在2020年10月的《iScience》杂志上发表了题为“Low shear stress increases recombinant protein production and high shear stress increases apoptosis in human cells”的文章。文中，研究人员指出，人胚胎肾细胞HEK293可用于生产需要翻译后修饰的治疗性糖蛋白。高细胞密度灌流工艺有利于这种产生，但由于HEK293细胞的剪切敏感性，而使操作具有不小的挑战性。为了解中空纤维过滤细胞分离装置的影响，研究在连接以不同流速操作的切向流(TFF)或交替式切向流(ATF)过滤装置的生物反应器中进行了细胞培养。这些装置中的平均理论流速特性显示，ATF的剪切力比TFF低0.637倍，研究通过实验对此进行了验证。此外，转录组学评估提供了对潜在的细胞过程的了解。高剪切引起的细胞应激可通过内质网应激、细胞骨架重组和外部信号通路三种途径导致细胞凋亡。研究观察到了温和剪切的积极作用，其可提高重组促红细胞生成素的生产，增加与转录和蛋白质磷酸化相关的基因表达。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
本文重点：
通过流体力学、转录组学和表型研究了解灌流的影响
温和剪切力对蛋白质的转录和磷酸化有正面的影响
高剪切力通过三种不同通路诱导细胞凋亡
中空纤维过滤器分离设备ATF中的平均剪切率低于TFF
在灌流模式下操作生物反应器可以连续更新培养基，在生物反应器中形成一个稳定而有益的环境，这有利于细胞代谢和生长，而更重要的是，可以提高单位体积产量和产品质量。这最近在生物制药领域激发了人们越来越大的兴趣。相比批次或补料分批工艺，灌流工艺仅需要更小的生物反应器体积以及更少的占地，这可显著降低资本支出。已经有许多针对使用哺乳动物细胞连续培养工艺进行单克隆抗体、糖蛋白和杆状病毒等产品生产的报道。
一个合适的细胞截留装置是成功进行灌流操作的关键。目前，有多种细胞分离技术被行业应用于灌流工艺，如基于重力的细胞沉降器、旋转滤器、离心、切向流过滤(TFF)以及交替式切向流(ATF)过滤。切向流过滤由于颗粒不会直接压入滤膜，所以可降低过滤器膜污染。在这些系统中，基于中空纤维过滤器的细胞分离技术是最有效的，并已证实可支持极高细胞密度的生物药生产过程。由Shevitz 发明的交替切向流过滤可以通过在过滤膜中形成反冲，而可进一步降低膜污染。在ATF中，细胞悬液通过安装在中空纤维一端的隔膜泵从生物反应器泵入中空纤维过滤器内腔，然后反向返回生物反应器，而在TFF中，细胞悬液仅沿一个方向循环。
许多哺乳动物细胞对剪切力或机械力敏感，已有多项研究表明，高水平的剪切力会影响细胞的活性和生长。理想情况下，工艺需达到高细胞密度，同时保持高生产力，且细胞不应遭受显著的剪切或机械损伤。因此，操作参数应仔细筛选，以确保流体力学条件不会对细胞造成严重损害。在基于中空纤维的灌流培养设置中，发生剪切细胞损伤的地方主要有两个：生物反应器和细胞分离装置。在生物反应器中，通气和相关的泡沫及气泡的形成，以及用于促进培养均质化的搅拌桨所产生的搅动，都可能是有害的。能量耗散率(EDR)解释了所有潜在的流体应力类型，通常用于表征流体流动和在已建立细胞的生物工艺中可能破坏细胞的流体力学条件。已有文章研究了生物反应器中不同来源产生的EDR，并鉴定了对细胞的非致死和致死作用。EDR和剪切应激与剪切损伤的来源有特定的关系。在细胞分离装置中，细胞通过中空纤维内腔而产生剪切。中空纤维腔内的液流流动可以用牛顿流体的泊肃叶流动（Poiseuille Flow）来描述。
虽然中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生物制药行业的“主力”，但人源性的替代细胞，如HEK293细胞，可以提供具有翻译后修饰的重组糖蛋白，这对某些治疗适应症至关重要。例如，HEK293细胞最近已被用于生产几种凝血级联重组因子，如VIII因子，此外，也被用于促红细胞生成素或酶生产的商业探索。
本研究的目的是了解TFF或ATF中，用于细胞分离的中空纤维过滤器所产生的剪切力对HEK293细胞的影响。文章从理论上研究了这两种过滤系统的流速特点和剪切力。为了支持这些结果，实验研究了生产重组人红细胞生成素(rhEPO)的HEK293细胞系在平行批次实验中对流体动力作用的敏感性，操作时，使用配备了TFF或ATF的微型生物反应器系统，并在不同的流速条件下进行。此外，通过转录组学系统性地研究了HEK293细胞对剪切力的整体功能性反应，从而对表型研究进行了进一步的补充。文章介绍了剪切力对HEK293细胞功能的影响，包括在氧化应激、细胞骨架重组、内质网应激、凋亡和细胞周期等细胞功能中的表现。
详细实验操作和结果，请参考原文。
讨论
对于管道中的流体，特别是切向流过滤器，流速和剪切率之间的关系已经建立。在这里，文章首次计算了ATF装置的理论剪切率，结果表明，由于TFF和ATF在流速分布上的差异，ATF产生的剪切力比TFF低0.637倍。为了模拟细胞在ATF和TFF灌流操作中所经历的剪切环境，在装有中空纤维过滤器的HEK293细胞平行批次培养中，比较了不同流速条件下，ATF和TFF的效应，从而实验证实了上述结论。研究观察到ATF≥0.7 L/min和TFF≥0.38 L/min时的生长速率较低，说明高流速和高剪切力对细胞不利。根据理论结果，将生长速率表示为平均剪切力的相关函数，显示ATF和TFF所得到的趋势非常吻合，且实验证实了，相比TFF，在ATF模式中，中空纤维过滤器内的剪切力较低。
实验原理图(A)切向流过滤，TFF，泵1是一个Alitea XV泵，流速为0.19 L/min，或两个平行安装的Alitea XV泵，流速0.38 L / min，或安装两个单向阀的ATF2隔膜泵，流速>0.38 L/min；(B)交替式切向流过滤，ATF。
使用(A)不同泵管GORE STA-PURE或PharMed，(B)不同流速的ATF和(C)不同流速的TFF进行批量培养，结果显示活细胞密度和活性。
而对于细胞代谢，实验发现剪切力对葡萄糖代谢的影响在以剪切力阈值分开的高、低两个剪切力区域内有一个双相行为。在低剪切力区域，细胞特异性葡萄糖摄取率qgluc，乳酸生产率qlac，随剪切力和流速而降低，这些代谢率在高于剪切力阈值时增加。这种双相行为可以如下解释，当低于剪切力阈值时，细胞受益于剪切力，更高的剪切力可促成更高效的葡萄糖代谢。然而，当高于剪切力阈值时，增加剪切力会负面影响细胞，这点可通过更高的代谢率来解释，即更高的qgluc和更高的qlac，以及细胞凋亡相关基因增加的mRNA的表达。
ATF和TFF系统中不同流速对细胞特异性葡萄糖消耗速率qgluc、细胞特异性乳酸产率qlac及qlac/qgluc比值的影响。
能量耗散率(EDR)考虑了所有可能的流体应力类型。该参数通常用于描述水动力条件，特别是用于评估生物工艺中潜在的细胞损伤。为了对目前观察到的效果与文献报道进行比较，以1L/min流速为例，计算了中空纤维中的EDR，并与此前报导的工作进行了比较。对于该流速，EDR范围在下图中画的红色虚线之间，其中剪切力阈值以红星表示。这些数值与先前发表的研究所报道的数值范围相同，即约0.1 L/min的流速通过直径为1 mm的管道以及通过200 μL的微量移液器吸头，分别在下图中标记为项目9和10。这些EDR值明显低于报导的不同细胞系已建立的致死水平，但仍在可能发生非致死影响的范围内，如有报导显示，提高剪切力会引起CHO细胞中重组人生长激素生产的降低，同时伴随葡萄糖消耗的增加以及乳酸生产的降低。对于高剪切力，在本研究中观察到的相反的影响是，在这里，乳酸生产增加。注意，就我们所知，此前还没有关于机械剪切对HEK293细胞影响的数据报道。在剪切力条件下，推测细胞需要快速获得能源，当剪切力高于阈值时，观察到qlac / qgluc增加，由于更高的糖酵解以及乳酸产量的增加，即Warburg效应，而不是氧化磷酸化(即柠檬酸循环)。这种增加的Warburg效应不能归因于氧的剥夺，因为更高的剪切力符合在细胞分离装置中更短的滞留时间的特点。对于TFF和ATF来说，与较低的流速相比，更高的流速可以形成更高的单位时间循环次数、更高的剪切力以及单次循环中更短的剪切暴露时间。
各种流体动力影响所产生的能量耗散率。1 L/min流速通过中空纤维（纤维数量13；纤维内径1.0 mm）的能量耗散率范围在红色虚线之间；五角星表示在本研究中确定的HEK293细胞的剪切率阈值为4900S-1。
高剪切力引起细胞凋亡的有害影响此前已有报导。有意思的是，目前的研究揭示了高剪切力通过与内质网应激、细胞骨架重组和细胞外通路相关的三条路径促进细胞凋亡。我们之前发现，在极高细胞密度条件下，氧化应激可能是由于较高的剪切力造成的。这与目前观察到的基因集富集结果一致，在高剪切力下，氧化应激、叶酸代谢和UPR升高。此外，参与这些通路的许多基因与剪切力表现出强烈的正相关。与氧化应激反应相关的叶酸代谢(通过MTHFD1L, MTHFD2)与ATF4_基因表达相关。ATF4_基因表达也涉及UPR和线粒体功能障碍。在高剪切力条件下，UPR和细胞应激相关基因表达升高，而在低剪切力条件下，与转录、细胞周期、蛋白磷酸化和细胞分裂等细胞过程相关基因表达较高，从而对细胞有正向作用。上述的生物过程随着剪切力的增加而稳步增加，因此它们在高剪切力下显著上调，而在低剪应力下，细胞对应激的反应增强。
基因表达与剪切力的关系。在与剪切率特异性相关的基因中，我们发现了与导致细胞死亡的不同生物过程相关的三组主要基因(红、绿、蓝)以及一些代谢基因；TFF:绿点，ATF:紫点。
更重要的是，研究发现低剪切力增加了重组蛋白的转录，即这里的rhEPO。据我们所知，温和剪切力的这种有利影响还未被报道用于稳定重组细胞系，但将这种影响与已知的温和剪切对原代细胞或干细胞的有利影响联系起来可能是一个有趣的研究方向。例如，此前有报导，拉伸后人体肌腱成纤维细胞的细胞增殖和蛋白质生产增加；牛肺动脉内皮细胞在静水压力作用下呈现细胞增殖和bFGF释放；在血管化研究中，低剪切力促进内皮祖细胞和胚胎干细胞的增殖，增强其形成新血管的能力。虽然在本研究中没有观察到细胞生长的增加，但低剪切率下rhEPO转录的增加可能通过一种与原代细胞或干细胞类似的机制而介导。
培养参数对HEK293细胞EPO生产的影响。
总结来说，我们研究了两种基于切向流过滤的系统(ATF和TFF)对分泌EPO的HEK293细胞灌流工艺中的剪切力效应。首先，建立了ATF和TFF系统平均剪应力的理论关系rATF≈0.637rTFF。然后，通过实验研究确定了ATF和TFF系统的一般剪切力阈值，在此阈值以上，可观察到HEK293细胞生长下降，细胞代谢改变。
行业对上游灌流工艺的兴趣越来越大，已将其作为实施连续生产工艺战略的一部分，以实现蛋白质治疗药物的经济商业化生产。已有许多关于将灌流工艺成功用于CHO细胞的报道，因为CHO细胞相对更为稳健。然而，其它较为脆弱的细胞类型正在成为重要的细胞“工厂”，用于需要特定翻译后修饰或难以在CHO细胞中表达的复杂蛋白的生产。因此，更好地理解剪切力水平及其对细胞(如HEK293)的影响至关重要。这里，研究证实高剪切力不仅会引起细胞生长的降低，还会导致代谢的改变，而温和的剪切力有利于重组蛋白的生产。此外，研究还对不同的细胞-剪切相互作用区域进行了表征，加深了对培养在基于中空纤维的灌流系统中的细胞的了解。预期在这里观察到的现象也可能发生在其它细胞类型中，我们相信这些知识有利于更好地设计新的灌流工艺。
原文：C.Zhan, G.Bidkhori, H.Schwarz, et al., Low shear stress increases recombinant protein production and high shear stress increases apoptosis in human cells. ISCIENCE, 2020, doi: https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101653.
ATF工作原理
XCell ATF系统简介
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