同一套RNA-seq，为什么公司做的跟师兄跑的结果不一样？ | TPM、read counts、RPKM/FPKM你选对了吗？
在RNA测序分析，哪家公司适合我一文中，聊过类似的问题。
这次小哈搬来了statQuest的3个最新视频，https://statquest.org/video-index/，点击左下角“阅读原文”直达statQuest视频目录。帮你理清RNA-seq数据预处理方法，哪个更适合你的问题。
先说结论：
学术界已经不再推荐RPKM、FPKM；
比较基因的表达丰度，例如哪个基因在哪个组织里高表达，用TPM做均一化处理；
不同组间比较，找差异基因，先得到read counts，然后用DESeq2或edgeR，做均一化和差异基因筛选；如果对比某个基因的KO组和对照，推荐DESeq2。
如果找公司做RNA-seq数据处理，计算表达量时，记得要read counts。
RPKM/FPKM、TPM
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=q05510q9xy4&width=500&height=375&auto=0
在RNA-Seq分析|RPKM, FPKM, TPM, 傻傻分不清楚？里，根据上面的视频用汉语描述了这三个值的区别。
下面是视频截图
不再用RPKM/FPKM，现在推荐用TPM
一表看懂TPM更适合比较同一基因在不同sample间表达丰度的差异
DESeq2或edgeR
DESeq2和edgeR不用RPKM/FPKM或TPM做均一化，而是直接用原始的read counts做均一化处理。
DESeq2和edgeR能很好的解决这两个问题
测序深度的差异问题，用RPKM/FPKM、TPM、DESeq2和edgeR都能处理
如果组间RNA成分差异较大，怎么办？
例如liver跟spleen比，组织特异性表达基因在里面捣乱；再例如常见的某个基因KO组与对照相比，该基因成分在KO组里缺失。
DESeq2做均一化
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=w05515xu5kz&width=500&height=375&auto=0
用edgeR作均一化
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=g05517d3wyj&width=500&height=375&auto=0
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