用于细胞灌流培养的规模缩小模型
来自英国剑桥大学和MedImmune等的研究人员在2019年的《Biotechnology and Bioengineering》杂志发表了题为“Enhancing the functionality of a microscale bioreactor system as an industrial process development tool for mammalian perfusion culture”的文章。文中，研究人员指出，如果没有规模缩小的灌流模型，灌流相对较高的资源需求会对细胞系筛选或工艺开发造成不小的挑战，进而导致可能成功细胞系或灌流工艺无法实现，灌流的能力也无法发挥。文中，研究人员介绍了一种高容量微型系统的功能重设，该系统一般用于补料分批工艺的开发，但可利用重力沉降和自动取样，实现灌流操作。在这个通常需要搅动混合的低资源需求设置中，pH值和溶解氧浓度可控，特异性产率和最高细胞密度分别可达≥3.0×10^6 mg/cell/day和7×10^7cells/mL，可复制以每天一个罐置换体积进行的微量规模灌流运行。研究与采用细胞截留装置的实验室规模灌流反应器进行了对比分析。接种后19天，不同规模间的特异性产率和产品聚集（6%）所指示的产品质量均无显著差异，说明该装置是一种合适且可靠的平台，可用于评估细胞系性能以及工艺参数的影响。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
自1986年第一款单克隆抗体（mAb）获批以来，对mAb治疗药物的需求已经发展成为了价值数十亿美元的市场。对基于补料分批细胞培养的大型生产设施进行工艺优化可实现高质量mAb的足够产量。另一方面，使用灌流生物反应器的连续生物工艺被用于较难表达或回收的产物的生产。连续生产系统更短的生物反应器内滞留时间以及毒性副产物的连续去除，可使细胞达到更高的密度，提高整体功能性生产。目前，连续生产已被广泛接受用于不同产品的生产，如表达滴度特别低的英夫利昔单抗（Rmicade）以及需要降低生物反应器中滞留时间的凝血VIII因子（ReFacto）。
随着对治疗性mAb生产需求的增加，安全、效价以及质量领域做了重大提升，而使用规模缩小模型进行工艺稳健性的研究，在这其中扮演了重要角色。自动化的一次性使用微量规模生物反应器系统被评估作为大规模补料分批生物工艺系统的规模缩小模型。据报道，微量规模生物反应器可通过实现多因子工艺优化，缩短进入商品化生产的时间线，符合当前质量源于设计（QbD）的指南。在微量规模和大规模中，pH和溶氧（DO）可精确控制。大规模条件下的工艺控制需要对系统的物理特性及其局限性有充分的了解，这些可以在微量规模条件下进行研究。
随着对连续生物工艺兴趣的增加，特定的工业化应用正在被逐个评估，包括可操作性、环境友好性以及经济性等方面的评估。对连续工艺选项的考量需在兼容的时间维度和操作复杂性范围内进行全面的工艺开发和优化，而在过往，其通常针对补料分批工艺建立，且微量规模系统对其至关重要。据报道，商品化的补料分批微量规模系统性能足以规模放大至实验室台式规模。但以连续模式操作的微量规模系统还有待评估，以从工艺参数角度，确定操作的可放大性，例如可支持的最高细胞密度、产量以及产物质量属性。
为达到极高的细胞密度，灌流工艺需要使用细胞截留设备。此类设备利用物理特性，如细胞大小（过滤）或密度（重力沉降或离心），且其性能已在不断增加的规模条件下进行了评估。采用现有的补料分批微量规模细胞培养系统进行连续细胞培养应用，对于灌流工艺开发来说，是一个相对较新的路径。由于微量规模系统的高度工程化特性，所以通过配用一个细胞截留设备，以将其用于灌流目的，通常较为困难。基于微孔板的系统，如SimCell平台（Seahorse）以及BioLectorPro（m2p labs）可提供较高的实验容量。但是，这些系统需要大量的操作员干预，才能通过已采用的细胞截留方法学，模拟灌流。也有报道评估了用于培养基开发的小规模灌流模型，但是这些系统通常不能实时评估和控制工艺参数，以进行广泛的生物工艺开发工作。
最近，有研究人员开发了专用于以灌流模式进行操作的微量规模系统，但还没有在哺乳动物表达系统背景下进行评估，而且，作为新应用，从最终用户角度看，这必然需要进行大量的经济和技术投入。
培养罐内的重力细胞沉降可作为灌流的方法，而不需要另行配置细胞截留设备。早前使用传统重力沉降设备进行的研究可成功用于微量规模细胞沉降方法的设计。使用该策略的早期应用以及多项工业化研究重新引起了行业对该方法的兴趣，尽管还没有专门针对该系统的全面比较性评估。
这里，我们介绍使用重力细胞沉降，在假灌流操作模式下，微量规模生物反应器系统的开发和比较性评估。微量规模生物反应器系统的操作容量（24-和48-罐版本）以及机器人液体处理臂被开发用于设计有效的灌流模拟微量规模系统。从沉降时间考虑，研究了搅拌和气体鼓泡暂时中断对培养罐的影响，以评估高容量系统的操作灵活性。微量规模灌流模式中，表达mAb的哺乳动物细胞系的产量以及产物质量，与使用中空纤维过滤器作为截留设备、以交替式切向流过滤（XCell ATF，Repligen，US）操作的常用台式规模灌流生物反应器中的相应参数进行了比较。
材料和方法
生长环境和培养条件
本研究使用表达高浓度双特异性抗体的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。使用两种无动物成分的专利培养基配方，一种专门开发用于传代培养（基础），另一种开发用于支持高细胞浓度的灌流系统（富集）。细胞取自冻存的细胞原液，在摇瓶中培养扩增，分瓶两次，使用基础培养基，扩增在湿化摇床中进行，温度37℃，5% CO2含量。
微量规模和台式灌流工艺操作模式
在实验1中，两个7L 台式规模搅拌生物反应器（Chemglass，US）和24个15ml微量规模生物反应器（ambr15，Sartorius，Germany）使用相同的种子细胞接种，以基础培养基培养，起始体积分别为3.5L和15ml。灌流开始后，台式规模和微量规模的工作体积分别调节为3L和10.7ml。两个台式规模罐以1VVD（每日罐置换体积）的速度操作。微量规模生物反应器以1.0VVD或1.5VVD的速度操作。数据仅报道以1.VVD操作的培养，以方便对不同的规模进行比较。在实验2中，12个微量规模生物反应器（ambr15）接种相同的种子细胞，使用基础培养基，以进行平行操作，起始体积为15ml。罐以1.0VVD速度操作。
以1.0VVD操作的微量规模反应器每天进行3次培养基置换，每步间隔8小时。以1.5VVD操作的微量规模罐每天平均进行4.5次培养基置换，相继一天进行4或5次置换，间隔5小时，4次置换的一天其中一个间隔为8小时，以匹配1.0VVD培养进行的日常采样。所有培养从灌流开始起，使用富集的培养基进行灌流，约为接种后96小时。
通过重力细胞沉降进行细胞截留和无细胞培养基置换，以实现微量规模生物反应器中的假灌流操作模式。台式规模罐使用ATF设备，以灌流模式进行操作，结合0.2μm中空纤维过滤器进行细胞截留，连续灌流速率为1.0VVD。两个7L搅拌罐生物反应器的pH和DO使用探针（MettlerToledo，US）进行在线监测，而在微量规模生物反应器中，使用位于底表面的荧光点传感器（Presens，Germany）进行监测。pH（7.2）和DO（50%）控制分别通过CO2和O2鼓泡进行维持。搅拌随氧气需求增加而增加，并按需添加消泡剂。
微量规模细胞截留 – 液体置换步骤
罐排列在每个培养站的1-6位置。通过停止鼓泡和搅拌，实现重力细胞沉降，以进行液体置换。初步研究后，实验1中，所有培养站使用30min的沉降时间，实验2评估在两个培养站中评估了33.5和37min的沉降时间。
液体以<0.9ml体积从罐内批量去除，尽可能控制吸头插入液体的量，以避免影响细胞沉降。这可通过调节自动化微量规模系统的软件实现，其可精确控制从罐内转移液体的移液吸头的高度（精确度为0.01mm）。通过衡量在不同记录高度和深度吸液后剩余的液体，绘制吸头高度vs.罐体积的图（斜率=0.3899；y轴截距=0.6203；R2=0.9987），根据该图，确定取样移液吸头。使用微量规模控制器实现自动化的连续液体置换，该过程需要20-30min，然后细胞重悬，恢复通气。
生物反应器取样和样品分析
所有罐每天取样。使用自动化Vi-Cell XR细胞计数仪（Beckman Coulter，US）进行活细胞计数和活性百分比分析。使用YSI 2900（Xylem Analytics，USA）和Bioprofile FLEX（NovaBiomendical，US）对微量规模罐和搅拌罐采集的样品进行葡萄糖和乳酸浓度离线代谢物分析。使用液相色谱（ACQUITYUPLC系统，AccQTag UltraC18柱，Waters，US）分析废弃培养基的氨基酸含量，峰与商品化标准品比较。出于商业机密，所有值都进行了缩放。mAb浓度在Octet系统上确定（Pall ForteBio，US）。纯化的mAb产物连续稀释，与内部分析对照平行运行，以确定滴度和对照品运行偏差。mAb聚体使用SEC-HPLC确定。未纯化的澄清细胞培养上清液使用0.22μm Acroprep过滤器过滤，然后自动注射上样至UPLC的SEC柱，在220nm和280nm波长下确定峰。每个实验（微量规模1、2A、2B和台式规模）收集汇合的灌流物料进行Protein A捕获纯化，使用SEC-HPLC确定聚体丰度。
计算
综合活细胞浓度、特异性葡萄糖消耗以及特异性乳酸变化的计算已有文章介绍。简单来说，每个培养的综合活细胞浓度（IVCC）按以下公式计算：
其中，VCC表示活细胞浓度，t为时间，下标n和n-1表示连续的取样点。
特异性葡萄糖消耗（qc,n）按以下公式计算：
其中D、mx和cx分别为每日稀释速率、新鲜培养基中检测的葡萄糖和培养中检测的葡萄糖浓度。
乳酸特异性净变化（ql,n）根据培养中检测的乳酸（px）进行计算：
没有发生产物截留，所以特异性产率按以下公式计算:
结果和讨论
沉降时间和细胞培养浓度对细胞截留的影响，以及由此产生的pH值和溶氧(DO)的影响。(a)微量规模罐的示意图，说明在罐内部底表面上的光学传感器的位置。罐几何结构的测量值摘自Nienow等文章(2013年)。(b)中国仓鼠卵巢细胞培养液浓度为2×10^7 cells/ml (左图)和1×10^8 cells/ml(右图)的两个微量规模罐。上图(B1)显示了重力沉降开始时的均质培养物，而下图(B2)显示了沉降30min后的相同罐。在已沉降30min的罐中，可以看到沉淀物层和已澄清的部分，如虚线框所示。(c)通过将重力沉降时间从15min逐渐增加到30min，在细胞保持后，微量规模反应器罐中细胞损失百分比，初始浓度为6.08×10^6 cells/ml。
与台式规模操作相比，微量规模系统工艺中pH和DO对细胞沉降的响应，以及随后对细胞生长和活性的影响。(a1)实验1中一个微量规模罐的样品追踪；工艺过程中记录的在线DO(红色)和pH(蓝色)检测值。这两个参数分别与工艺持续时间(天)绘制。在一天的培养过程中，酸度和含氧量的变化对应三个置换步骤（1.0 VVD 体积置换率)，显示了液体步骤之间的回收率，以控制设置点。(a2)（a1）一个沉降周期的放大图，代表系统对细胞沉降和重悬的响应。(b)微量规模罐和两个实验台式规模反应器的细胞活性（%)与培养时间(天)的关系。(c)微量规模罐和两个台式规模反应器的活细胞密度(cells/ml)与工艺持续时间(天)的关系。(d)每液体交换步骤的细胞损失(%)由灌注液的总细胞含量与悬浮培养的总细胞数的比值决定，并与培养天数相对应。(e)微量规模培养(●)和灌流液(〇)中细胞样品的平均细胞直径。
在线和离线测量工艺参数中培养对模式和细胞截留持续时间的响应。在线微量规模罐读数分别在24小时内取平均值，以提供一天的代表性值。所有参数均与工艺持续时间（天）相关联。(a) DO(%)，在线(b) pH值，在线(c)葡萄糖(g/L)，离线(d)乳酸(g/L)，离线(e)特异性葡萄糖消耗速率(g/cell/day)，(f)特异性乳酸净变化(g/cell/day)，(g)滴度(mg/L)，离线(h)特异性产率(mg/cell/day)。
详细实验结果和分析，请参考原文。
总结
在本研究中，实验探索了一种基于假灌流模式的微量规模生物反应器系统的设计和性能。利用重力沉降实现细胞截留，有效的细胞截留需要>30min的沉降时间，有95%的细胞可在液体置换前沉降，细胞沉降阶段的上限应接近或短于41min，以在延长的培养周期中，维持>86%的活性。
对于实验中的细胞系，该微量规模系统支持与台式规模操作中可比的最大细胞密度，培养可达到非常高的细胞密度，≥7.0×10^7cells/ml，且不受氧限制或培养环境酸度增加的挑战。微量规模操作和台式规模操作在培养pH上的细微差异并没有在CHO细胞生理上产生差异，特异性葡萄糖消耗和净乳酸产率保持相似。
目前的设置可以使用48‐或24‐罐版本。在每天一个罐体积的液体置换率下，该设置允许适当的维护停机时间以及每天有一个操作员干预操作。我们的评估显示了该装置在进行多因素DoE、以有效评估灌流工艺设定点、培养基优化或作为细胞系筛选工具方面的潜力和适用性。
原文：D.J.Sewell, R.Turner, R.Field., et al. Enhancing the functionality of a microscale bioreactor system as an industrial process development tool for mammalian perfusion culture. Biotechnology and Bioengineering. 2019;116:1315-1325.
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