通过捕获层析纯化AAV载体
本文节选自“Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification”，更多详细内容，请参考原文或往期文章“
AAV细胞培养液的收获和澄清”。
典型AAV下游工艺示意图。
捕获层析是用于将生物产物从杂质中分离出来的第一步层析，通常在上游工艺的收获步骤之后进行。在捕获层析过程中，目标是将AAV载体与层析基质上的特定配基或形态结合，从而浓缩并纯化AAV载体。对于AAV，亲和层析、离子交换层析和疏水作用层析被广泛接受作为基于捕获的形式，因为它们可从料液中以不同的效率分离AAV。亲和层析法依赖于可结合AAV衣壳特定区域的独特亲和配基，而离子交换层析和疏水作用层析分别依赖于AAV衣壳和杂质（如基因组DNA）之间的静电作用及疏水性的差异。
最初的开发工作主要围绕对基于AAV2血清型有特异性的亲和配基，纯化工艺使用A20抗体或基于肝素的亲和层析。而进一步的研究发现，AAV5血清型可以使用粘蛋白(一种富含唾液酸的哺乳动物蛋白，存在于唾液、肠液和其它分泌物中)作为层析基球上的配基进行一步纯化。虽然这些方法很有效，但由于操作成本高、结合不同血清型的能力有限以及来源于动物成分等原因，并未被广泛用于AAV治疗药物的大规模cGMP生产。最近的发展已经引入了商业化的、基于骆驼单结构域抗体片段、针对不同AAV血清型的重组亲和配基。这些配基对AAV衣壳有很高的亲和性，同时允许杂质通过层析柱，通过一步纯化就可以达到高纯度。该技术的潜力在一项研究中得到了充分的说明，与三步离子交换工艺相比，单步亲和捕获可获得相当纯度的物料(通过SDS-PAGE检测)。
第一个商业化的骆驼源性填料是AVB Sepharose™ High Performance，该填料结合了琼脂糖(Sepharose™)基球和从自然暴露于野生型AAV的美洲驼中分离出来的配基。因此，在该填料的制备过程中，我们发现所选择的抗体片段与含血清型1、2、3和5衣壳的AAV载体具有很高的亲和性。AVB配基的结合表位最近被鉴定为SPAFKA表位，其结合强度与跟该表位高度同源的AAV血清型相关。有研究表明，将该区域替换为低结合的血清型，可能可以为提高该填料的通用性提供可行的解决方案。AVB Sepharose™ High Performance的“继承者”是Capto™ AVB，它使用相同的配基，但连接到Capto™ ImpAct 基球上（一种更为刚性的基质），提供优化的压力-流速特性。基于针对5种血清型的测试，AVB声称的结合载量是10^12 vg/mL，收率在50-92%之间。
随着行业对其它各种AAV血清型兴趣的增加，基于针对这些特定衣壳的单域抗体片段的筛选，Thermo Fisher开发了POROS™ CaptureSelect™ AAV8和AAV9。最近，鉴于AAV衣壳上高度保守的表位，POROS™ CaptureSelect™ AAVX也被开发出来，其可与大多数血清型相结合，结合载量在10^13-14 vg/mL之间。由于使用了POROS™聚合物基球，促进了液流流动和传质，因此POROS™ CaptureSelect™具有优异的液流性能，在流量为150-450 cm/hr之间，具有相当的性能。在最近的一项研究中，研究人员发现，对于测试的不同天然和合成型血清型，POROS™ CaptureSelect™ AAVX具有极高的静态结合回收率(>95%)。该数据证实了POROS™ CaptureSelect™ AAVX作为不同AAV血清型平台化填料的潜力。
鉴于研究人员对将AAV作为基因传递载体的兴趣的增加，用于亲和捕获步骤的填料和技术的新发明也在不断发生。两个值得关注的例子是最近推出的AVIPure™AAV9 (Avitide)和AVB配基与Fibro层析(Cytiva)的结合。AVIPure™AAV9使用了一种AAV9特异性的小肽连接剂，声称与其它血清型特异性填料相比，具有更出色的HCP清除能力，且载量相当，而洗脱缓冲液更为温和(pH值> 3.0)。Fibro层析介质为电纺纤维素纤维，可实现高流速和高结合载量。保留时间可以快至1-2秒，比传统基球填料(如Capto™AVB)增加50倍以上，可以消除捕获前的浓缩步骤。
与用于商业化治疗性单克隆抗体生产的Protein A填料类似，这些新型AAV亲和配基的结合条件允许使用严苛的漂洗条件，以减少杂质的非特异性相互作用，并减少产品池中的整体杂质挑战。AAV与这些亲和配基的结合发生在中性条件下，洗脱通常发生在酸性条件下。典型的结合和漂洗缓冲液是磷酸盐缓冲盐(PBS)， 10-50 mM Tris和10-50 mM磷酸钠，pH 7 - 8，添加或不添加氯化钠。对于洗脱，建议使用醋酸钠、柠檬酸、甘氨酸和磷酸盐，pH值在2 - 3之间，此外，通常使用添加物（如NaCl）来提高回收率。尽管AAV在低pH条件下感染性在较短时间内可保持稳定，但随后对洗脱池进行中和是必要的，以降低在这些条件下的暴露，并为之后的层析步骤做准备。洗脱后，建议使用强酸性缓冲液，然后使用弱氢氧化物溶液来帮助层析柱再生。在针对Capto™ AVB的一项研究中，研究人员使用20mM Tris-HCl、500mM NaCl、pH 7.5的平衡和漂洗缓冲液，以及100mM乙酸钠、500mM NaCl、pH 2.5和100mM磷酸盐、500mM NaCl、pH 1.7的洗脱缓冲液来捕获AAV。
在生物药生产过程中，针对同一产品的多批次重复处理，重复使用层析填料/层析柱是一种典型的做法，以实现具有经济效益的商业化生产。含有蛋白质配基的亲和层析填料(如CaptureSelect™ AAVX)的高成本使得这一考虑尤为重要。填料的重复使用肯定需要考虑法规方面的问题。在生产过程中，需要进行全面的性能确认研究，记录有效的清洗、再生、消毒以及性能一致性，以达到预定的最大循环次数。此外，如果一个层析步骤在监管申请文件中被声称为除病毒步骤，可能需要在层析柱填料寿命结束时，进行病毒检测研究，以证明在声称的层析柱寿命内，具有一致的病毒清除能力。
下表所示为可选择用于AAV亲和捕获层析的商业化填料以及每种填料的特点。
除了亲和层析，离子交换层析已被广泛地探索作为初步捕获步骤。由于衣壳表面的净电荷在宽泛的pH (pI 5.9 - -6.3)内，离子交换层析法可以作为捕获步骤，但往往不具有高度的选择性，因为捕获上样料液中存在大量的带电杂质。这导致需要进行多个纯化步骤。
疏水作用层析的使用也被探索作为AAV的捕获步骤。有工业化纯化平台采用了CIMmultus™ OH整体柱作为捕获步骤。疏水作用步骤使用磷酸钾缓冲体系(pH 7.0)，上样条件为1.5M， AAV洗脱时，梯度降低至50mM。
总的来说，可以使用多种不同技术从收获料液中初步捕获AAV载体。亲和层析显示出了最大的应用前景，特别是在考虑平台化方法时。AVB和AAVX填料在单步捕获层析中都取得了成功，这些商业化AAV亲和填料可满足生物治疗药物商业生产的典型质量标准。但是，虽然这些亲和填料对于AAV衣壳表现出了很高的特异性，但它们不能分离空衣壳和完整衣壳，因此，如有需要，需要使用额外的纯化步骤来进行分离。
上表所示为不同捕获层析方法的文献报导，包括了相应的填料和形式。虽然单步亲和层析捕获步骤已被证明可以达到相对高的纯度，但是额外的层析步骤可能还是需要的，以达到非常低的杂质（如DNA和细胞蛋白）水平，以及实现空衣壳和完整衣壳的分离。
原文：B.Adams, H.Bak, A.D.Tustian, Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification. 2020, Biotechnology & Bioengineering, https://doi.org/10.1002/bit.27472.
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