扩增子分析QIIME2. 4-沙漠土分析实战Atacama soil

原创 2017-07-31 刘永鑫 宏基因组

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声明：本文为QIIME2官方帮助文档的中文版，由中科院遗传发育所刘永鑫博士翻译并亲测有效，文档翻译己获QIIME2团队官方授权。由于QIIME2更新频繁，如使用中遇到问题请访问QIIME2官方论坛阅读最新版中文帮助。https://forum.qiime2.org/t/qiime2-1-chinese-manual/838 如中文翻译没有急时更新，新阅读英文原版 https://docs.qiime2.org本人只习惯使用命令行模式分析数据，图形界面和Ipython模式下使用暂不介绍。本系列的教程主要以命令行方式为大家演示。在其它方面有使用的经验的朋友，欢迎共享您的使用笔记于“宏基因组”公众号，方便大家学习和使用。

扩增子分析QIIME2. 4阿塔卡马沙漠微生物组分析

原文地址： https://docs.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/

此实例需要一些基础知识，要求完成本系列文章前两篇内容：1简介和安装和2分析实战Moving Pictures。

本教程设计有两个目的：熟悉双端数据的处理；基于Moving Pictures后的主自分析练习以积累项目经验。

实验设计

本实验研究对像为智利北部的阿塔卡马沙漠。此地为世界上最干旱的地区之一，其中有些地方十年降水量不足1毫米。尽管这里极端干旱，但仍有微生物生活在这里。我们的采样地点为东部的Baquedano和西部的Yungay，发现土壤温度与降水量正相关。在这两个地点，我们挖坑，并在不同深度取三组样品。

实验数据下载

# 激活工作环境
source activate qiime2-2017.6

# 建立工作目录
mkdir qiime2-atacama-tutorial
cd qiime2-atacama-tutorial

# 下载实验设计：Google文档在中国大陆无法下载，直接使用我建立的备用链接
# wget -O "sample-metadata.tsv" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/sample_metadata.tsv"
wget http://bailab.genetics.ac.cn/markdown/QIIME2/atacama-soils/sample-metadata.tsv

# 下载双端实验数据(使用10%抽样数据方便下载和演示)：分别为正向、反向和barcodes序列三个文件；文来自亚马逊云，有时无法下载或断开，只下载一个文件不同时间多试几次就成功了。
mkdir emp-paired-end-sequences
wget -O "emp-paired-end-sequences/forward.fastq.gz" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/10p/forward.fastq.gz"
wget -O "emp-paired-end-sequences/reverse.fastq.gz" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/10p/reverse.fastq.gz"
wget -O "emp-paired-end-sequences/barcodes.fastq.gz" "https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/10p/barcodes.fastq.gz"

双端数据分析方法

# 双端数据导入，数据建库类型为EMP双端序列(本示例来自EMP项目)
qiime tools import \
   --type EMPPairedEndSequences \
   --input-path emp-paired-end-sequences \
   --output-path emp-paired-end-sequences.qza

# 按Barcode进行样品：--m-barcodes-file为含有样品与barcode信息对应的实验设计，--m-barcodes-category指定含有barcode信息的列名称，--i-seqs输入文件，--o-per-sample-sequences输出文件， --p-rev-comp-mapping-barcodes为barcode方向，是用实验设计的barcode与测序文件比对确定方向，此分析中为反向互补
qiime demux emp-paired \
  --m-barcodes-file sample-metadata.tsv \
  --m-barcodes-category BarcodeSequence \
  --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza \
  --o-per-sample-sequences demux \
  --p-rev-comp-mapping-barcodes

# 对拆分样品的结果和质量进行统计
qiime demux summarize \
  --i-data demux.qza \
  --o-visualization demux.qzv

# 展示统计分析结果
qiime tools view demux.qzv

质量分析后，我们根据上图结果和相关表格来确定下步denoise分析参数。详细信息查看点下面链接
https://view.qiime2.org/visualization/?type=html&src=https%3A%2F%2Fdocs.qiime2.org%2F2017.6%2Fdata%2Ftutorials%2Fatacama-soils%2Fdemux.qzv 。网页中交互式图形可以查看每个碱基位置的详细信息。

去噪并生成Feature表和代表性序列

设置左端截掉13bp，右端不截。(我通常处理是先合并双端，再质控，再去引物，虽然复杂更感觉更合理。但此方法可能更适合EMP项目，每个人的设计不同，参数不同)

qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
  --o-table table \
  --o-representative-sequences rep-seqs \
  --p-trim-left-f 13 \
  --p-trim-left-r 13 \
  --p-trunc-len-f 150 \
  --p-trunc-len-r 150

# 查看Feature/OTU表的统计结果
qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv

# 代表性序列统计
qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv

结果本地qiime tools view查看，本地没有配置可视化环境的，请下载文件在线查看 view.qiime2.org
大家先本地或在线分析Feature表和代表性序列的统计结果，先熟悉数据。再按照2分析实战中方法，继续建树、多样性分析及比较，回答下面的问题？

接下来分析并回答的问题

接下来OTU表标准化参数—p-sampling-depth应该选多少？有多少样品应该从实验中剔除？过滤后核心矩阵中有多少数据量？
实验设计中的那种分级方式中微生物组成差异最大？采用那种距离计算方法分开更明显，是unweighted UniFrac还是Bray-Curtis？考虑尝试使用qiime diversity beta-correlation and qiime diversity bioenv分析结果，可以使用--help查看详细帮助。
使用qiime diversity alpha-correlation分析样品间的相关性，看看能得到什么结论？
按组分析Alpha多样性，并比较是否有显著差异？
在门水平查看不同温度下微生物组成？看那些种类与湿度相关？
在有无植被的取样地点，什么菌门差异明显？

Acknowledgements

本文的数据来自干旱土壤微生物组：显著增加与温度，在mSystems正在审稿

Reference

https://docs.qiime2.org/2017.6/tutorials/atacama-soils/
The data used in this tutorial is presented in: Arid Soil Microbiome: Significant Impacts of Increasing Aridity. Neilson, Califf, Cardona, Copeland, van Treuren, Josephson, Knight, Gilbert, Quade, Caporaso, and Maier. mSystems (under review).