Uni-FEP如何“破解”难成药靶标KRAS G12D？ | 靶点“探月”计划
还在为难成药靶点而苦思冥想设计策略？难成药靶点一直是靶向药物设计中的难题，国内外无数的研究机构都在不断探索高效的设计策略，但成功案例凤毛麟角。本文将为您深入展开：使用深势科技自研药物设计平台Hermite™中的自由能微扰计算模块Uni-FEP对难成药靶点KRAS G12D的靶向药物设计的探索。
关于KRAS G12D
RAS癌基因是第一个被发现的人类肿瘤基因，也是人类肿瘤中最常见的突变基因之一[1]。RAS蛋白错义突变会减少GTP水解，改变GDP和GTP的稳态平衡[2]。在KRAS的基因突变中，以第12位的突变最为常见，其中最主要的是G12D、G12V、G13D这三种突变。针对KRAS G12C的抑制剂，已有Sotorasib（AMG 510）成功上市[3]，Mirati Therapeutics的Adagrasib（MRTX-849）也进入NDA阶段。然而，在全球范围内，针对KRAS G12D，目前尚无有效的靶向药物进入临床研究。
KRAS与GTP的亲和力极强，可达到皮摩尔水平，比蛋白激酶对ATP的亲和力强1000倍以上，且细胞中GTP浓度很高，因此很难像蛋白激酶抑制剂一样，实现针对GTP结合位点的有效竞争。KRAS蛋白表面平滑，具有近乎球形的空间结构，缺乏较深的疏水口袋，阻碍了高亲和力抑制剂的识别，因此一直被业内认为是典型的难成药靶点。人类致力于KRAS的研究长达四十余年，直至近年，才有共价靶向KRAS G12C突变亚型的药物上市，但靶向其他RAS突变，如KRAS G12D的药物仍然是研发的难点和各大药企关注的重点[4]。
从目前已有文献和专利来看，针对G12D的开发策略分为共价结合和非共价结合两大类。在非共价结合抑制剂的进度方面，Mirati Therapeutics和Taiho Pharmaceutical都有一定的研发进展，国内也有包括多家企业在布局和进行相关研究。
探索KRAS G12D计算模型，
使用Uni-FEP验证已发表化合物
与KRAS G12D的结合能力
深势科技团队使用自研药物设计平台Hermite™ Uni-FEP将自由能微扰理论、分子动力学、增强采样算法与高性能计算相结合，成功探索出KRAS G12D的计算模型，快速验证了已有活性的16个化合物（包括：Mirati Therapeutics公司专利的10个化合物和文献报道的6个化合物[5]）与KRAS G12D的结合能力。
为评估预测的可靠性，深势团队将不同小分子与蛋白的结合实验数据转化为结合自由能数据，并计算预测结果与实验结合亲和力数据的相关性。其中，Mirati Therapeutics公司公开发表文章中化合物数据为HTRF活性数据，同时部分化合物具有TR-FRET实验数据，后续的计算将对其做两次评估。
· TR-FRET实验数据的计算与验证
图1中10个来源于专利的化合物。
图1 用于Uni-FEP计算的10个专利化合物，MRTX1133以双盐桥增强与KRAS G12D结合
表1为Uni-FEP计算结果与TR-FRET实验结合亲和力数据比较表格。10个化合物的计算△G(Uni-FEP)排序与实验△G(EXP_TR-FRET)的整体趋势吻合，这表明Uni-FEP通过计算药靶结合自由能，可对一系列化合物进行较为准确的亲和力预测排序。图2为计算结合自由能与实验亲和力的相关性分析，从图中可以发现，两者成高度线性相关（R²=0.91），均方根误差（Root Mean Squared Error，RMSE）为0.77。这表明，Uni-FEP在用于评价系列化合物亲和力排序中准确性较高，优势明显。
表1 10个专利化合物Hermite™ Uni-FEP计算结果
图2 10个专利化合物Hermite™ Uni-FEP计算结果与实验结果相关性分析
· HTFR、TR-FRET实验数据的计算与验证
图3为Mirati Therapeutics公司公开发表文章中的另外6个化合物。通过追溯专利可整理得到这些化合物与TR-FRET以及HTRF的亲和力实验数据，其中HTRF测出的亲和力相较于TR-FRET结果更有区分度（表2）。
图3 用于Uni-FEP计算的6个文献化合物
表2 6个文献化合物Hermite™ Uni-FEP计算结果
Uni-FEP的计算结果在TR-FRET和HTRF中均与实验值呈现出高相关性（图4），预测的结合自由能与实验数据的线性相关性R²分别为0.77（图4a）和0.76（图4b）。在相关系数接近的情况下，Uni-FEP预测结果和HTRF实验结果的均方根误差RMSE为1.38（图4b），小于Uni-FEP预测结果和TR-FRET实验结果的均方根误差2.04（图4a）。这表明，Uni-FEP在与区分度更好的HTRF实验结果中表现更好（RMSE越大，表明潜在的计算误差越大）。这一结果，也与实验数据中HTRF实验数据相比TR-FRET实验数据更能区分化合物与蛋白结合能力的趋势保持一致。
图4 文献中6个化合物Hermite™ Uni-FEP计算结果与实验结果相关性分析（a，b分别为专利TR-FRET实验数据和文献HTRF实验数据）
总结
KRAS G12C抑制剂取得成功之后，科学家们已经将目标转向其它KRAS突变体。本文使用Hermite™ Uni-FEP探索了KRAS G12D与已发表化合物的计算模型，准确地预测KRAS G12D靶蛋白与配体的结合自由能。通过分别计算化合物与TR-FRET、HTRF的结合自由能，Uni-FEP的计算结果在与区分度更好的HTRF实验结果中也同样表现更好。
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参考文献
[1] 李歆. 特异靶向KRAS-G12C突变的抗肿瘤药物研究进展[J].药学学报，2021,56(02):374-382.
[2] Haigis K M. KRAS alleles: the devil is in the detail[J]. Trends in cancer, 2017, 3(10): 686-697.
[3] Loong HH. KRAS G12C mutations in Asia: a landscape analysis of 11,951 Chinese tumor samples. Translational Lung Cancer Research. 2020 Oct; 9(5):1759-1769.
[4] Moore A R. RAS-targeted therapies: is the undruggable drugged [J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2020, 19(8): 533-552.
[5] Identification of MRTX1133, a Noncovalent, Potent, and Selective KRAS G12D Inhibitor.JMC.2021.
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关于Uni-FEP
Uni-FEP是药物计算设计平台Hermite™中的药物结合自由能计算模块，为先导化合物优化提供了精准计算的可能。Uni-FEP将自由能微扰理论、分子动力学、增强采样算法与高性能计算相结合，能够以化学精度高效评估蛋白质与配体的结合亲和力，适用于R基团优化、骨架跃迁、配位共价、电荷转移、大环成环等各种不同的优化场景。
关于Hermite™
Hermite™是深势科技打造的基于人工智能、物理建模和高性能计算的新一代药物计算设计平台，致力于为药物研发工作者提供一站式解决方案，满足多种场景的药物研发需求。Hermite™以网页应用的形式，提供多种药物设计功能，帮助药物设计人员完成从靶点结构解析、预测与精修，到苗头化合物筛选，再到先导化合物优化和性质预测的一体化工作。Hermite™提供友好的可视化交互界面、功能实时更新，同时支持本地和云上的私有化部署。
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