TrkA激酶抑制剂， Uni-Aquasite显著提高分子亲脂效率｜“水”形物语

Uni-Aquasite是深势科技Hermite^®继Uni-Fold、Uni-FEP、Uni-EM 、Uni-Mol等“Uni-”系列产品后推出的新功能，主要应用在先导化合物优化阶段，可准确预测蛋白中关键水的位置及其能量。

“水”形物语系列是Hermite^® Uni-Aquasite的系列案例推文，我们将在案例中选取特定靶点，使用Uni-Aquasite对配体周围关键水的位置及能量进行预测，期望为药物分子设计提供结构基础和指导思路。

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随着结构生物学的快速发展，大量与疾病密切相关的蛋白结构得到解析，极大地促进了基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD） 的发展。利用 SBDD 进行化合物的结构优化迭代， 已经在药物研发过程中发挥了不可替代的重要作用。

水分子广泛存在于药物靶蛋白中，对于药物与靶蛋白的相互作用具有重要贡献。在药物设计中，对水分子的处理大概可以分为三类：保留、取代（替换）或删除。具体采用哪种方式，需要根据水分子所处的状态决定，而判断水分子的状态又是一件难事。近年来，涌现出一系列通过合理替换水分子，提高化合物的结合活性、增强化合物的选择性、改善其药动学性质的案例。在本期Uni-Aquasite“水”形物语中，我们以TrkA为靶点，选取了文献中具有代表性的化合物作为配体，使用Uni-Aquasite预测配体周围关键水的位置及其能量，提高分子的亲脂效率。

Trk概述

原肌球蛋白受体激酶（Tropomyosin Receptor Kinase，Trk），是原癌基因Trk的产物，由原肌球蛋白和酪氨酸激酶融合产生。Trk受体可分为TrkA、TrkB和TrkC，其相应的配体分别为神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子3(NT-3)，神经营养因子4/5(NT-4/5)也是TrkB的配体。神经营养因子主要通过Trk家族的酪氨酸激酶受体的自身磷酸化进行信号转导，产生效应，因此Trk激酶抑制是一种潜在的药物干预点（图1）。该干预点在神经营养蛋白信号级联中处于高水平，且适合小分子治疗慢性疼痛疾病^[1,2]。

图1 神经营养因子NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5

及其受体TrkA、TrkB和TrkC

Uni-Aquasite准确预测配体周围关键水的位置及其能量

Uni-Aquasite能够准确预测配体周围关键水的位置及其能量，主要用于先导化合物优化阶段。根据Uni-Aquasite结果合理处理配体周围的水分子以提高或降低化合物的活性或改善其药动学性质。本案例从Sharan K. Bagal 等人发表的文章中选取化合物2和化合物3以及其与TrkA的holo晶体结构（PDB ID：6DIY和6DIZ），探究了Hermite^® Uni-Aquasite计算配体周围关键水自由能及指导先导化合物优化的能力。

· 计算体系

在Sharan K. Bagal 等人发表的文章中^[3]，通过分析holo晶体结构的水分子并结合基于片段药物设计的方法，合理取代配体周围的水分子，不仅提高了激酶的选择性而且改善了分子的亲脂效率。本案例选取化合物2和化合物3以及其与TrkA的holo晶体结构（PDB ID：6DIY和 6DIZ），使用Uni-Aquasite快速计算化合物2周围关键水的位置及其能量，用以验证利用Uni-Aquasite预测水位置及水自由能的准确性。

选取的化合物结构和活性如图2所示：

图2 化合物2和化合物3结构、活性及性质

· 计算过程

Hermite^® Uni-Aquasite提供完整的、自动化的Uni-Aquasite计算流程和结果分析指导，整个流程包括：蛋白准备、配体准备、结果分析、预测水与蛋白的整合和结果下载。

化合物2对TrkA具有良好的抑制活性和选择性，但亲脂效率（lipophilic efficiency，LipE）仅为2.2，有较大的提升空间（图2）。文献报道，激酶铰链区的水分子可成功的被亲脂性基团取代，而甲基吡唑暴露于激酶出口的溶剂区域，该区域可以增加化合物极性降低其亲脂性^[4,5]。

如图3所示，Uni-Aquasite预测出配体周围水分子的位置与结晶水高度一致（带有红色氧原子的水分子为holo结构中的共晶水，颜色一致的水分子为Uni-Aquasite预测的水）。从图中可知在激酶的铰链区有一系列自由能相对较高的水分子（红色圈出），而在化合物2结构上的甲基吡唑位置附近有一系列自由能低的稳定水分子（绿色圈出）。基于水分子的状态，作者设计了一系列分子经筛选后发现化合物3活性较化合物2显著提高，对TrkA 的IC₅₀达到50 nmol/L，并保持了TrkA比TrkB/C高80倍的选择性。从图4可知化合物2结构中苯环上的一个氢被氨基吡啶取代后，激酶铰链区部分不稳定的水分子被取代掉，提高了化合物3的活性（被取代的结晶水位置是963和1020，Uni-Aquasite准确预测出水的位置和能量值，ΔG分别为-0.487 kcal/mol和-0.628 kcal/mol）。而吡啶环上的甲基被甲酰胺取代后，甲酰胺会与氨基酸侧链形成氢键相互作用，取代了附近稳定的水分子，增加了化合物3的脂水分配系数（logD = 2.3），分子的亲脂效率也得到了提高（LipE = 5.0）。

结论

本案例选择TrkA抑制剂优化过程中具有代表性的化合物2及其TrkA holo晶体结构，利用Hermite^® 平台的Uni-Aquasite模块对化合物2周围水分子位置及其状态进行了预测。结果表明Uni-Aquasite预测水的位置与结晶水高度一致，且预测的能量与化合物优化的逻辑一致。验证了使用Hermite^®  Uni-Aquasite能够准确预测配体周围关键水的位置及其能量，从而指导先导化合物的优化的工作。

TIPS

为什么水的能量为-0.487 kcal/mol和-0.628 kcal/mol时，还会被称为不稳定水？大家可能对此会有疑惑，小编在此为大家简单介绍下水分子occupancy与自由能的关系。

如果p为某个位点水分子的occupancy，让一个水分子从体相中到水合位点上的自由能为 ，那么有R=  = 。当p=0.5时，=0的水分子出现在体相中和水合位点中的概率相同。

当T取298K时，1kcal/mol = 1.689 kT，

当 = -1.3kcal/mol时，计算得到p=0.9，即这个位点水分子的occupancy为90%；

当 = +1.3kcal/mol时，计算得到p=0.1，即这个位点水分子的occupancy为10%；

当-1.3kcal/mol<  <1.3kcal/mol时，水分子occupancy介于10%到90%之间，可以看做水分子处于某种亚稳的状态^[6]。

进行水分子替换时，可以考虑替换掉不稳定的水分子或部分亚稳状态的水分子，避免替换掉那些相对自由能在-1.3 kcal/mol以下甚至更低的水分子。

参考文献

[1] Burgess, G.; Williams, D. The discovery and development of analgesics: new mechanisms, new modalities. J. Clin. Invest. 2010, 120 (11), 3753−3759.

[2] Skaper, S. D., et al.The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods Mol. Biol. (N. Y., NY, U. S.) 2012, 846, 1−12.

[3] Bagal S K , Omoto K , Blakemore D C , et al. Discovery of Allosteric, Potent, Subtype Selective and Peripherally Restricted TrkA Kinase Inhibitors [J]. J. Med. Chem. 2019, 62, 1, 247–265.

[4] Robinson, D. D.; Sherman, W. Farid, R. Understanding Kinase Selectivity through Energetic Analysis of Binding Site Waters. Chem. Med. Chem. 2010, 5 (4), 618-627.

[5] Murphy, R. B.; Repasky, M. P.; Greenwood, J. R., et al. WScore: A Flexible and Accurate Treatment of Explicit Water Molecules in Ligand–Receptor Docking. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59 (9), 4364-4384.

[6] Ross G A , Russell E , Deng Y , et al. Enhancing Water Sampling in Free Energy Calculations with Grand Canonical Monte Carlo [J]. J. Chem. Theory Comput., 2020, 16(10):6061-6076.

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关于Hermite^® Uni-Aquasite

Hermite^®是深势科技打造的基于AI for Science新范式的新一代药物计算设计平台，致力于为药物研发工作者提供一站式解决方案，满足多种场景的药物研发需求。Uni-Aquasite是Hermite^®最新推出的关键水分子自由能计算模块，可通过计算得到每个水分子的自由能，找出靶点结合位点处的稳定水分子和不稳定水分子的位置，为药物分子设计提供结构基础和指导思路。

如何试用

平台地址：hermite.dp.tech

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