药物设计“手术刀”Uni-FEP解析Eg5靶点变构口袋分子 | 靶点“探月”计划
变构调节
变构调节是几乎所有生物学的核心，包括信号转导、转录调节和代谢控制。许多致病突变，包括许多癌症驱动突变，都是病理性的，因为它们具有变构效应。相反，许多有效的抑制剂并不直接抑制蛋白的活性位点，而是通过与变构位点的结合来改变蛋白的活性。变构药物通常具备比活性保守位点结合的正构药物更高的特异性，能够克服耐药性突变、具有毒性小、受体脱敏效应小的优势[1]。
Eg5靶点及变构抑制剂
Eg5被称为驱动蛋白（kinesin spindle protein，KSP），是哺乳动物体细胞中心体分离和纺锤体组装的关键调节因子，是开发抗有丝分裂药物抑制剂的有效靶点。Eg5可以在有丝分裂期间与纺锤体相互作用以形成和稳定双极纺锤体结构。通过抑制剂抑制Eg5可以破坏细胞的分裂过程，从而干扰细胞增殖，这一过程对其他细胞生命周期进程没有任何显著影响。因此，Eg5是癌症治疗中潜在有效、安全和选择性的靶点[2-3]。
图1：Eg5靶蛋白结构示意图，PDB ID：6G6Y
在过去20年中，科学家通过筛选获得了许多具有不同化学骨架的Eg5抑制剂。这些抑制剂可以分为两个大类：一类是结合在ATP口袋的竞争性抑制剂；另一类是靶向Eg5运动结构域中的特定变构位点口袋的变构抑制剂。本文的研究重点主要针对Eg5变构抑制剂。
图2：Eg5主要抑制剂骨架
Eg5变构抑制剂的作用位点主要由helix α2/loop L5和helix α3组成，其距离ATP结合位点约10埃左右的距离。变构抑制剂结合后会导致Loop L5从“打开”状态重排到“闭合”状态，通过变构传递引起ATP结合口袋中的构象变化，减慢ADP的释放，并最终导致Eg5被困在“ATP样”构象中，生理功能受到抑制[2]。
图3：Eg5正构位点与别构位点。左上是变构位点，右下是ATP结合位点
Uni-FEP准确预测变构
抑制剂与Eg5结合自由能
· 计算体系
为探究Hermite™ Uni-FEP在变构位点结合自由能中的计算效果，本文将目光聚焦于靶向Eg5变构抑制剂，挑选了8个含噻二唑结构的化合物进行计算[4]。计算使用的Eg5复合物晶体结构PDB ID为6G6Y，该结构为图4中的化合物Cpd1与Eg5别构位点结合的晶体复合物结构。
图4：Uni-FEP计算的8个化合物
· 计算过程
利用Hermit Uni-FEP提供的自动化计算流程，完成蛋白结构的准备、配体结构的准备以及化合物的自动对齐。
图5：化合物自动对齐后构象
验证化合物叠合模式良好后，Uni-FEP自动构建出合理构建微扰网络图（图6）。
图6：微扰网络图Pertubation Network。Exp为实验△G值，E为实验△G差值（△△G）。箭头上数字为化合物间的相似度
· 计算结果
表1为Hermite™ Uni-FEP计算△G与实验结果△G的比较表格。8个化合物的实验值和预测值具备良好的对应关系。单独分析每个化合物的计算结果和实验结果，所有化合物的预测结果与实验结果偏差均小于1 kcal/mol，计算精度很高（备注：对于FEP的计算而言，预测值与实验值间的差值小于2 kcal/mol属于精度可以接受的范围）。
表1 Hermite™ Uni-FEP计算结果与实验结果比较
进一步分析预测自由能与实验自由能的相关性（图7），计算值与实验值呈显著间线性相关R²=0.58，均方根误差RMSE为0.4，表明Uni-FEP在Eg5的变构位抑制剂预测体系中，已经具备完美反映化合物实验亲和力的能力。
图7：FEP计算结果图，横坐标为实验△G值，纵坐标为计算△G值
总结
Hermite™ Uni-FEP在Eg5变构抑制剂的自由能预测当中表现出了令人惊叹的效果，这表明在变构抑制剂的设计场景中，FEP是具备很大的潜力。在未来，深势科技不仅将探索更多不同靶点的变构位点，进行分子活性预测，同时也将在别构位点的搜索和寻找方面进行进一步的创新研发，为业界打造从“别构位点识别”到“别构位点抑制剂设计”的完整方案。
Hermite™ Uni-FEP 靶点“探月”计划更多靶点案例，请参考：
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致谢
感谢浙江大学药学院沈哲远博士在Eg5体系中对FEP计算做出的重要贡献。
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参考文献
[1] Faure, A.J., Domingo, J., Schmiedel, J.M. et al. Mapping the energetic and allosteric landscapes of protein binding domains. Nature 604, 175–183 (2022).
[2] Isabel Garcia-Saez., Dimitrios A. Skoufias., et al. Eg5 targeting agents: From new anti-mitotic based inhibitor discovery to cancer therapy and resistance. Biochemical Pharmacology, 184, 114364(2021)
[3] Ogunwa, T.H. Laudadio, E. Galeazzi, R. Miyanishi, T. et al. Insights into the Molecular Mechanisms of Eg5 Inhibition by (+)-Morelloflavone. Pharmaceuticals, 12, 58. (2019)
[4] Sandeep K. Talapatra, Chuin Lean Tham, Paolo Guglielmi, et al. Crystal structure of the Eg5 - K858 complex and implications for structure-based design of thiadiazole-containing inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry 156, 641-651 (2018)
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关于Uni-FEP
Uni-FEP是药物计算设计平台Hermite™中的药物结合自由能计算模块，为先导化合物优化提供了精准计算的可能。Uni-FEP将自由能微扰理论、分子动力学、增强采样算法与高性能计算相结合，能够以化学精度高效评估蛋白质与配体的结合亲和力，适用于R基团优化、骨架跃迁、配位共价、电荷转移、大环成环等各种不同的优化场景。
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Hermite™是深势科技打造的基于人工智能、物理建模和高性能计算的新一代药物计算设计平台，致力于为药物研发工作者提供一站式解决方案，满足多种场景的药物研发需求。Hermite™以网页应用的形式，提供多种药物设计功能，帮助药物设计人员完成从靶点结构解析、预测与精修，到苗头化合物筛选，再到先导化合物优化和性质预测的一体化工作。Hermite™提供友好的可视化交互界面、功能实时更新，同时支持本地和云上的私有化部署。
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