基于ATF灌流的瞬时基因表达工艺，用于HEK293细胞
来自美国国立卫生研究院的科学家们在今年的一期《Biothechnology Progress：Cell Culture and Tissue Engineering》杂志上发表了题为一篇题为《Development of an alternating tangential flow (ATF) perfusion-based transient gene expression (TGE) bioprocess for universal influenza vaccine》的文章。文中实验使用人胚胎肾（HEK）293 细胞，开发了一种基于交替式切向流（ATF）灌流的瞬时基因表达（TGE）生物工艺，用于生产H1-ss-np，其是一种非常有前景的通用流感疫苗候选物。
为优化工艺，实验采取了两个主要调节措施：1）消除基因转染过程中微泡的干扰；以及2）利用ATF灌流系统延长培养周期，从而开发了一种基于封闭式操作的、为期9天的ATF灌流TGE生物工艺。该TGE生物工艺显示出具有高细胞活性的连续细胞生长，以及延长的细胞生产，重组产物水平可达到~270mg/l，是为期4天的TGE对照“基线”工艺的2倍多。此外，基于ATF灌流的TGE生物工艺的每毫克产物耗材成本相比对照TGE生物工艺降低~70%，说明其在疫苗生产中可实现较高的成本节省。鉴于更低的污染风险、更高的产量以及成本效益，基于ATF灌流的TGE生物工艺对于未来疫苗和药物生产中的多种应用都具有极大的潜在优势。
本文为研究内容简介，详细内容，请参考原文。
简介：瞬时基因表达（TGE）技术是已良好建立的生物生产工艺技术，用于满足重组蛋白生产需求。事实上，已有多种使用CHO或HEK293细胞系的TGE生物工艺被报导用于生产单克隆抗体（mAb）和病毒样颗粒（VLP）。此类TGE生物工艺通常使用补料分批策略，即在整个运行过程中，所有细胞和蛋白产物保留在相同的罐内。补料分批生物工艺有其天然的局限性：首先，在运行过程中，废弃产物会积聚在罐内，如细胞碎片和其它不需要的小分子，可能会干扰细胞生长、蛋白质生产以及生产的目的产物的稳定性；其次，必要的培养基置换和/或细胞浓缩需要在培养罐外以开放方式操作，这就需要更强的操作技巧，且可能造成较大的污染风险。此外，在补料分批生物工艺中，即使每日补充添加物，生产时长仍会受限于细胞活性的衰减。所以，需要可解决传统TGE补料分批生物工艺这些问题的优化技术。
灌流系统是一种可行的替代方案，其可连续补充培养基，截留产物，并选择性地去除废物。例如，使用基于交替式切向流（ATF）细胞截留装置的灌流系统，可从细胞培养体系中选择性地去除小于过滤器孔径的废物，并根据收获策略，将目的产物收集在滤液或截留液中。与此同时，罐上的液位探针或称量单元可检测细胞培养罐内体积的降低，信号反馈至系统控制器，以添加必要的培养基，维持工作体积的水平，从而补充用于细胞生长的新鲜培养基和营养底物。事实上，该策略已经被用于流感疫苗、重组蛋白和抗体生产研究，包括商品化产品的生产。
在本研究中，研究人员使用ATF灌流系统，开发了基于HEK293细胞的TGE生物工艺，以生产通用流感疫苗，H1稳定的干纳米颗粒（H1-ss-np）。H1-ss-np的结构性定义为铁蛋白纳米颗粒上高度保守的血凝素（HA）干区的八个三聚体的组合，其被证实可在小鼠和雪貂模型中诱导针对异型流感病毒的免疫反应。这些动物模型的意义很重要，因为这种通用疫苗可能可取代每年重复接种的季节性流感疫苗。为了在人体临床试验中进一步评估该疫苗的安全性和有效性，需要早期TGE生物工艺开发。因此，本文生物工艺开发聚焦于高产量ATF灌流系统，包括成功的瞬时基因转染和表达。
实验：
对照“基线”TGE生物工艺流程图。基线TGE生物工艺组成包括细胞生长、离心、培养基置换、细胞浓缩、转移至生物反应器、转染以及每日补液表达(J.Hong, et al., 2019)。
基于ATF灌流的TGE生物工艺流程图，组成包括细胞生长、培养基置换、细胞浓缩、转染以及表达，所有步骤均在同一罐内进行（J.Hong, et al., 2019）。
详细实验操作及结果，请参考原文。
实验使用3L Apllikon生物反应器，培养参数设定点分别为37℃、7.1±0.2 pH、50% DO、295 rpm（培养）或350rpm（转染和表达）。转染时搅拌速度增加至350rpm，目的是增加DNA和PEI与细胞膜互作的几率。
对于基于ATF灌流的TGE生物工艺，使用带50kD中空纤维过滤器（F2:RF50PS）的ATF细胞截留装置，泵速设置为0.7LPM，以截留细胞，并过滤细胞培养废物。同时，通过反应器液位控制信号，向培养体系补充新鲜培养基，以维持反应器内体积恒定。该控制系统可实现对于瞬时转染细胞最佳的条件，提高目的蛋白的产量。
进行培养基置换时，在转染前1天，ATF灌流系统以5VVD的速率运行24h，在此过程中，几乎97%的培养基从原培养基置换成FreeStyle 293培养基。在转染当天，使用ATF作为浓缩系统，将细胞浓缩至目标密度。一旦体积降低，细胞被浓缩后，关闭ATF灌流系统，细胞使用质粒DNA和PEI转染。转染后，使用表达培养基，将细胞稀释至目标密度，打开pH和DO控制至原始设定点。转染后24h，加入VPA（丙戊酸）。在转染后第1或4天，以25或100pl/cell/day（0.25VVD或1VVD）的速度启动灌流。在9天的培养过程中，监测平均活细胞密度（VCD）、活性、滴度以及代谢物水平。
总结：实验开发了用于H1-ss-np疫苗生产的、基于ATF灌流系统的新型TGE生物工艺。该工艺开发包括两个主要方面：1）生物反应器中PEI介导的基因转染的条件；以及2）针对单个系统转染操作的基于ATF灌流的系统实现，包括在单个罐内进行细胞浓缩、废物清除、培养基补充以及蛋白质表达。相比现有的TGE工艺，利用该策略，此新型生物工艺可达到高产量、成本效益，同时降低污染风险。
在TGE生物工艺中使用ATF灌流系统的优势还可进一步开发。本实验在工艺中只进行了单次转染，但通过灌流系统重复置换培养基并浓缩培养体系，可在相同的生物反应器内进行多次转染。此外，因细胞继续生长，可对灌流速率进行优化，以补充必要的营养物需求。基于本研究以及进一步优化的可能性，基于ATF灌流的TGE生物工艺在未来快速蛋白质表达以及疫苗和药物生产的多种应用中具有极大的潜在优势。
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本文为下文简介，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。
原文：J.Hong, J.Demoirji, D.Blackstock, et al., Development of an alternating tangential flow (ATF) perfusion-based transient gene expression (TGE) bioprocess for universal influenza vaccine. Biotechnology Progress: Cell Culture and Tissue Endineering, 2019, doi: 10.1002/btpr.2831.
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