离心与切向流过滤的比较研究：以纳米颗粒纯化为例
来自美国罗德岛大学的科学家们在2019年的《Particuology》上发表了题为“A comparison of centrifugation and tangential flow filtration for nanoparticle purification: A case study on acetalated dextran nanoparticles”的文章。文章研究探讨了各种因素对切向流过滤（TFF）纯化的纳米颗粒（NP）表征的影响，并将其与最常使用的NP纯化方法 – 离心相比较。实验使用紫杉醇作为模式小分子，采用试验设计（DoE）方法，研究了跨膜压（TMP）、流速和起始药物荷载（DL）对NP表征的影响。确定优化的TFF参数后，使用其它模式小分子（他克莫司和白藜芦醇）对两种纯化方法进行了评估。结果显示，TFF参数和药物起始荷载对纯化NP的结果影响较大。而与离心方法相比，TFF获得的NP更小，且载药量更高。TFF可规避与传统离心相关的问题，而获得相似的结果，是聚合物NP大规模纯化的一种合适方法。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
纳米技术在生物医学和制药科学中的应用极大地改变了疾病诊断和治疗的方式。聚合物纳米颗粒由于其生物相容性、可调节的特性以及环境响应性，成为了一种非常有吸引力的药物递送系统。通常用于聚合物NP制备的方法包括单或双乳化、纳米沉淀以及盐析。在制备过程中，药物一般物理性包封在纳米颗粒中，制备完成后，用纯化过程去除添加剂、表面活性剂和/或未包封的药物分子。
NP纯化最常用的方法是超速离心，其利用离心力从不需要的材料中分离最终产物。尽管这种方法简单易用，但如考虑到NP特性，离心的挑战其实不小。离心力会导致NP压实，形成结块和致密的NP聚团，需要费力的方法来确保充分的重悬，这可能会导致NP表征不一致，出现批次间差异。此外，离心还受到容器尺寸的限制，妨碍了以此进行大规模生产的可行性。
切向流过滤（TFF）是一种被广泛使用的纯化方法，使用TFF进行过滤时，含有溶质的流体沿过滤膜表面切向流动，从而以一种动态的方式进行纯化。这与传统的死端过滤方法不同，在死端过滤中，溶液垂直膜方向流动，很容易导致膜表面形成滤饼，从而降低整体的过膜滤液通量。而TFF中，目标溶质被截留，废物被有效去除。此外，可维持恒定的浓度梯度，并去除过量的介质，即溶质浓缩。
自1993年，TFF第一次被报道用于NP纯化以来，许多研究都在NP制备工艺中使用了TFF系统，包括纯化和包被。特别是，TFF作为一种始终如一且连续的方法，在脂质体制剂的纯化中获得了极大的关注。
为更全面地了解TFF关键参数（TMP、流速和通量）对纯化NP表征（粒径、电荷和分散性）结果的影响，研究人员使用DoE方法研究TFF流速和TMP以及起始载药的作用，实验选择乙酰化葡聚糖（Ac-Dex）作为模式聚合物载体，因其具有作为药物递送载体所需的良好生物相容性和生物可降解性，且可通过简单的一步反应法制备，允许经济且省时的合成。在DoE研究中，选择紫杉醇（PTX）作为模式药物包封进NP。此外，使用另两种疏水性小分子 – 他克莫司（TAC）和白藜芦醇（RSV），研究纯化工艺（离心 vs. TFF）对NP表征的影响。
详细实验步骤，请参考原文。
使用离心和TFF进行纳米颗粒纯化的系统性工艺概览。对于离心，DI水加入到NP悬液，之后离心（漂洗，上清1），重复该步骤（漂洗，上清2），NP重悬于0.1% PVA。对于TFF，NP悬液先进行初步过滤（洗滤，步骤1），之后加入0.05% PVA，进行浓缩步骤，获得15mL 浓缩的NP（浓缩，步骤2），最后清洗TFF膜，收集残留的物料（膜清洗，步骤3）（N.K.Shah, et al., 2019)。
使用TFF进行纳米颗粒纯化时，实验使用KrosFlo Research 2i TFF系统及500kD 改性聚醚砜 MidiKros 中空纤维过滤器，先将NP悬液浓缩至15mL，然后向悬液中加入0.05%（w/v）聚乙烯醇（PVA），进一步浓缩至5mL，使用的TFF参数如下表所示。获得的NP冻干并于-20℃储存。研究的详细切向流过滤因素（TMP、流速和起始PTX荷载）值以及用于纳米颗粒制剂实验设计（Box–Behnken Design，BBD）的水平（低、中和高）请参考原文。
结果与讨论
实验设计的因素研究范围的选择基于TFF厂商的推荐（TMP和流速）以及关于PTX-NP的先前经验。多个因素（TFF参数）会显著影响响应（NP表征）。改变TFF流速会影响NP的PDI值，提高流速可降低PDI值。较小的化合物（如未包封的药物分子或较小的NP）在更高的流速条件下，会更容易地滤出，从而获得更加均一的颗粒粒径，降低多分散系数（PDI）。该结果说明，为获得更窄的粒径分布，需要高流速。尽管zeta电位（ZP）受起始PTX载药的显著影响（DL增加，ZP增加），但NP可被认为是功能性电中性的。初始PTX荷载会显著影响NP的最终PTX荷载，所以初始和最终载药量之间呈正相关。
流速和TMP的不同组合会显著影响制剂中的NP粒径。提高流速，膜暴露时间降低，即降低膜污染的可能性。所以，膜表面形成的浓度梯度可允许更小的滤过性物质（如游离的聚合物、游离的药物分子和其它小颗粒）更容易地经扩散而通过膜。反过来，TMP增加可驱使更多的液体通过膜，从而提高过滤容量，但也增加了膜污染的可能性。此外，将TMP增加至接近或超过厂商推荐的值，还可能造成膜本身的破坏。所以，实验决定使用高流速和低TMP，作为获得直径范围145-150nm的NP的最佳方案。基于这些结果，进一步的研究可测试更低的TMP、更高的流速和更高的载药量。
TFF参数优化后，以优化的TFF参数（TMP = 2psi、流速=150mL/min、起始DL=10wt%），使用TFF进行载PTX、RSV和TAC NP的制剂，并以离心作为对照，比较纯化工艺对载不同小分子NP的表征的影响。结果观察到，离心后PTX-NP和TAC-NP的直径和PDI提高，可能是离心过程中发生的团聚所致。这种现象可能导致NP重分散困难，而较小的颗粒没有被去除以及较低的ZP值可能指示较低的PVA包被。相反，在TFF过程中，500kD膜可截留≥50nm的NP。TFF和离心纯化的NP的直径差异是由于技术间不同的机理造成的。离心使用离心力来分离，这种驱动力，加上重悬分散的差异，会形成更大的NP直径。而TFF使用一种动态的过滤过程，NP悬液沿膜表面不断地切向流动，降低了可能形成的团聚，实现基于粒径的分离。
纯化后ZP值的下降可能是由于在处理过程中，Ac-Dex暴露于NP表面所致（Ac-Dex带少量负电荷），所以，NP总体上可被认为是功能性电中性的。在使用离心进行纯化的过程中，NP悬液暴露于无PVA的介质，PVA被从NP漂洗掉。相反，TFF膜中的NP在含有PVA的介质中洗滤，从而使NP暴露于更多的PVA，获得更高的PVA含量。相比TFF，离心纯化的PVA含量更低。因为PVA为可溶性，在离心过程中，PVA扩散进入水中，而被从NP表面漂洗去除。而在TFF过程中的洗滤步骤中，有大量的PVA饱和介质在过程中保持不变，从而获得更高的PVA含量。
使用离心（左）和切向流过滤（右）纯化的紫杉醇纳米颗粒制剂的扫描电镜图。相比离心纯化的NP，TFF纯化的NP制剂中的PVA含量更高，而纯化的颗粒具有相似的形态，NP为具有光滑表面的球型，且TFF纯化NP粒径更为均一（N.K.Shah, et al., 2019)。
此前，有研究认为，相比TFF，离心可获得更高的药物载入。但是，在本研究中，相比离心，TFF纯化在PTX-NP和RSV-NP实验中获得更高的药物载入，仅TAC-NP的载量稍低。总体来讲，尽管所研究的模式药物的理化特性（化学结构、分子量、Log P和水溶性）有根本性的差异，但是在NP直径、PDI、ZP、PVA含量或载药量方面没有观察到相关的变化趋势。
在膜漂洗过程中（步骤3），大量的药物从TFF膜去除，说明mPES膜和游离药物分子及NP之间没有显在的相互作用。药物的理化特性在药物与膜的相互作用中扮演者重要的角色。例如，具有较高Log P值的药物可能会有较高的膜吸附。分子间的相互作用，如氢键结合、非极性相互作用，其另外一些可能导致药物与膜相互作用的原因，其可影响制剂的DL值。
总结
研究使用实验设计方法鉴定关键TFF参数以及起始药物荷载对NP表征的影响，结果发现，NP表征与多个因素有关，包括TFF流速和TMP、起始药物荷载。传统离心方法会因其产生的剪切力会影响NP表征，而TFF是一种相对自动化的工艺，具有良好的规模放大潜力，兼具纯化和过滤的能力，可规避与传统离心相关的问题，获得相似或更好的结果。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：N.K.Shah, R.Ivone, J.Shen., et al., A comparison of centrifugation and tangential flow filtration for nanoparticle purification: A case study on acetalated dextran nanoparticles. Particuology, 2019, https://doi.org/10.1016/j.partic.2019.06.004.
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