多之“毫厘”，一个水分子显著提升FEP精度｜靶点“探月”计划
FEP因能够精确计算药靶结合自由能，而受到业界广泛关注。然而在回顾性验证时，即使配体的结合模式与共晶复合物中原配体结合模式一致，自由能计算结果仍可能无法重现实验结合亲和力。针对此疑问，本文将为您深入展开：使用Uni-FEP探索水分子对配体与靶蛋白间相互作用的影响。
ACK1靶点
活化的Cdc42相关激酶1（ACK1/TNK2）是一种具有独特结构的非受体酪氨酸激酶。作为受体酪氨酸激酶（RTKs）的关键下游靶点，ACK1可以整合来自不同细胞类型的各种RTKs的信号，将RTKs的细胞外信号传递到细胞质和核效应器，并可能依次调节部RTKs的表达水平。目前对ACK1的研究主要集中于其在癌症中的驱动作用，在许多癌症中已观察到ACK1的突变和过表达。临床研究证明，抑制单一的RTK对某些癌症的疗效有限。然而，ACK1可以整合RTK的信号，这表明靶向ACK1的抑制剂有较大的治疗潜力。尽管在高通量筛选和各种传统药化研究中发现了一系列强效的小分子抑制剂，但因低选择性和成药性不佳等原因，尚无选择性化合物进入临床研究阶段[1]。
Uni-FEP准确计算已发表化合物与ACK1的结合自由能
· 计算体系
本文使用文献中报道[2]的6个含有4-氨基呋喃嘧啶类的化合物快速验证其与ACK1（PDB ID: 4EWH）的结合自由能，化合物的抑制常数范围跨度在1000倍以上，分子结构及Ki值如图1所示。
图1 用于Uni-FEP计算的6个文献报道的化合物及抑制常数
· 计算过程
Hermite™Uni-FEP提供完整的、自动化的FEP计算流程和结果分析指导，整个流程包括：蛋白准备、配体准备、化合物对齐（支持刚性对齐、柔性对齐）、化合物对的自动Mapping/Pertubation、构建微扰图、结果分析。
图2 化合物对齐后与ACK1靶点的结合
（左图不含水分子，右图含水分子）
图3 Uni-FEP构建的微扰图示意图
（Exp.为实验ΔG值，Calc.为计算ΔG值，ΔG单位为kcal/mol，箭头上数字为化合物间的相似度）
· 计算结果
表1为Hermite™ Uni-FEP计算ΔG 与实验ΔG的比较表格。从结果中可发现蛋白体系中不含有水分子计算ΔG与实验ΔG误差较大，并且根据预测值和实验值对化合物的排序也具有较大的差异。经研究发现有文章指出在ACK1激酶活性部分（ATP结合位点）中存在深埋的水分子，水分子在蛋白质−配体结合亲和力中常常起着重要作用[3]。因此，推测计算结果与实验值相差较大可能是因为在计算时未引入口袋深处的水分子，所以根据文献中的介绍手动放置水分子（如图2 右图）后再计算。
如表1所示Uni-FEP_H2O表示蛋白体系中加入水分子后计算的ΔG，从表中可知加入水分子后Uni-FEP的计算结果可以把药物优化过程中分子活性较高的分子挑出来，如化合物2和7。从图4可知加入水分子后Uni-FEP的计算结果RMSE得到了下降，且与实验结果的相关性得到了显著提升。
表1 Hermite™ Uni-FEP计算结果与实验结果比较
注：ΔGUni-FEP为未加水分子的计算结果，ΔGUni-FEP_H₂O为加水分子后的计算结果。
图4 Cycle closure所得绝对结合自由能ΔG预测值和实验值的相关性，横坐标为实验值，纵坐标为计算值。
（左图不含水分子，右图含水分子）
结论
本文以ACK1靶点为案例，探究了水分子对配体-靶蛋白间相互作用的影响。结果表明靶蛋白体系加入水后预测的结合亲和力与实验的结合亲和力值具有较高的相关性，证实了水分子在FEP计算时也是比较重要的。因此，可以说明体系的准备对获得准确的FEP计算结果是非常关键的。
Hermite™ Uni-FEP 靶点“探月”计划更多靶点案例，请参考：
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致谢
中国药科大学药学院白秦儒同学在ACK1体系中对Uni-FEP计算做出的重要贡献。
参考文献
[1] Wang, A.; Pei, J.; Shuai, W.; Lin, C.; Feng, L.; Wang, Y.; Lin, F.; Ouyang, L.; Wang, G., Small Molecules Targeting Activated Cdc42-Associated Kinase 1 (ACK1/TNK2) for the Treatment of Cancers. Journal of Medicinal Chemistry 2021, 64 (22), 16328-16348.
[2] Jiao, X.; Kopecky, D. J.; Liu, J.; Liu, J.; Jaen, J. C.; Cardozo, M. G.; Sharma, R.; Walker, N.; Wesche, H.; Li, S.; Farrelly, E.; Xiao, S.-H.; Wang, Z.; Kayser, F., Synthesis and optimization of substituted furo[2,3-d]-pyrimidin-4-amines and 7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amines as ACK1 inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22 (19), 6212-6217.
[3] Granadino-Roldán, J. M.; Mey, A.; Pérez González, J. J.; Bosisio, S.; Rubio-Martinez, J.; Michel, J., Effect of set up protocols on the accuracy of alchemical free energy calculation over a set of ACK1 inhibitors. PloS one 2019, 14 (3), e0213217.
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