抗体连续生产中Protein A层析柱上样的控制：实时滴度检测方法

Original XS Repligen瑞普利金 2022-12-21

来自美国Allogene Therapeutics等的科学家们在2019年的《Bioprocess International》杂志上发表了题为“Control of Protein A Column Loading During Continuous Antibody Production: A Technology Overview of Real-Time Titer Measurement Methods”的文章。文中，研究人员指出，在治疗性抗体生产过程中，需要检测收获液滴度，以检测上样至Protein A捕获层析柱的产物量，以避免层析柱低载（未充分利用昂贵的填料）或过载（产物流穿而被浪费），同时也便于计算层析柱产量。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

在批次生产中，可生成单个均质的收获液池，所以只需要进行一个滴度检测（随上样体积检测）即足以确定上样量，而在连续生产中，无细胞的收获液（滤液）从灌流反应器连续收获并上样至Protein A层析柱，所以产物滴度在上样过程中可能发生变化，需要进行多个滴度检测，以控制上样量。滴度检测结果必须可及时提供，以在达到目标量之后，停止上样。

在连续生产中，由于灌流反应器内细胞密度和细胞特异性产率的变化，在一定上样间隔后，protein A层析柱上样滴度会发生变化。图中所示系统使用两根平行的protein A层析柱（J.D.Goby）。

适合在连续生产中检测滴度和其它参数的方法正随着行业对连续工艺的采用而变得越来越重要。这种趋势的重要驱动力包括对生物药需求的持续增长，以及连续工艺相比批次工艺独特的优势：更低的设备投入成本以及厂房规模、更高的工艺灵活性以及产物质量的一致性。除传统离线滴度检测所需具备的特点外，连续生产中滴度检测还有频繁性和及时性要求。

选择滴度检测方法时的一些考量因素取决于检测的形式（离线、近线、随线或在线），对术语的定义如下：

离线（off line）：手动采样，检测在生产区域外进行
近线（at line）：手动采样，检测在生产区域范围内进行
随线（on line）：自动采样，检测在生产区域内进行
在线（in line）：无采样，检测在生产区域内、使用置于样品液流中的探针进行

其它与方法形式无关的因素包括检测频率、准确性以及精确性，所有这些因素都会影响上样量检测的准确性，其可概念化为描绘滴度和上样体积的曲线下的面积。曲线下的每根柱的面积为增加的上样量，等于滴度值乘以该滴度检测后的上样体积。当滴度再次检测后，重新开始计算上样体积。以所有柱的总和估算总上样量。

上样过程中的滴度检测，乘以上样体积，而曲线下方柱的面积，所有柱的总和约等于总面积和一次循环冲的上样量（J.D.Goby）。

滴度上升过程中检测频率过低会丢失曲线下较大的面积，导致低估上样的量（或在滴度降低时，造成高估）。偏置和不精确性也会导致不准确的上样量，但如果在整个上样过程中，采集了足够数量的滴度检测值，可以克服这种不精确性。另一种方法是在员工精力和成本允许情况下，取每个样品的多个检测值的平均。

其它与方法形式无关的影响因素包括：

设备的成本效益和故障风险（可靠性）
结果的及时性（确保及时停止层析柱上样，从而防止低载或过载）
当用于GMP生产时，进行方法验证的能力
需要手动采样和分析时，向生产操作员提供结果并操作设备所需的员工时间

通过使用自动取样器，以及自动分析滴度结果并将结果从分析设备传输至控制生产工艺的监视控制和数据采集（SCADA）软件，可节省员工时间。一些供应商的软件设计可与SCADA软件包无缝通讯，而一些供应商需要“中间件”，以将设备的通讯翻译成SCADA软件可以解读的形式。

此外，因为要求将分析设备置于限制性的生产区域内，所以还有几个与旁线、在线和在位方法相关的考量因素，如设备占地，发生故障时，维修或更换的及时性，如何设置备选方案以及使用在位方法时，如何确保无菌性以及方法的验证等。

光学方法 – FlowVPE设备（在线）：FlowVPE设备是C Technologies提供的近线SoloVPE斜率光谱设备的自动化、在线版本。两个版本都通过改变光纤在样品中的垂直位置，来测量吸光度/光程曲线的斜率，从而推算样品的浓度。吸光度通过连接VPE单元和独立的Cary 60分光光度计的光纤电缆来测量。SoloVPE设备目前在多个GMP生产厂房，使用经验证的方法，被用于检测纯化的产物浓度。

SoloVPE和FlowVPE设备。

当一根Protein A层析柱在上样中达到平衡，从出口流出的流穿（FT）物料含有所有除与填料结合的抗体产品外的上样成分。斜率光谱法利用这一情况，从上样信号中减去FT信号，从而推断滴度。所以，检测滴度时，用户检测层析柱入口和出口的样品，建立一个将信号差与上样滴度关联的校准值。

基于上样体积绘制的protein A上样和流穿（FT）的吸光度示例；上样吸光度来源于抗体、培养基以及代谢物；FT吸光度仅来源于培养基和代谢物。所以，吸光度的差值即可指示滴度（J.D.Goby）。

使用减除方法需要注意的是，当上样成分快速变化时 – 比如由于细胞密度快速变化 – FT组成也会快速变化。在快速变化上样成分时，与上样同时采集的FT或者之后的多个柱体积的FT，不等于上样滴度减去mAb上载量。上样后1个柱体积采集的FT可给出最准确的滴度结果。

自动化的在线FlowVPE简化了频繁且及时的结果的获取，所以对于连续生产来说，是比SoloVPE更好的选择。优势包括高检测频率（通常可达每~11秒一次）、通过模拟信号将结果发送至SCADA软件的及时性、以及显著降低采样以及分析的人员时间需求。且C Technologies报导其已可提供在GMP生产环境中使用的可高压灭菌的不锈钢流动池，而一次性使用版本也在开放当中，因此，方法验证相对简单。

考虑到两种设备的相似性，研究人员在实验室使用SoloVPE计量FlowVPE的精确性和准确性。实验采集了4种标称上样滴度在不同柱体积条件下的上样物料，使用SoloVPE设备和传统的Protein A HPLC方法检测每种样品的滴度。SoloVPE滴度误差＞5%，但是，整合滴度/体积曲线（每个SoloVPE滴度乘以上样体积，然后求和），对于所有样品（除最低上样滴度0.3 g/L），误差≤4%。所以，如上所述，整合一个上样的多个独立检测值，可克服方法的不精确性，使设备可在更高上样滴度条件下，提供足够准确的质量值。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：J.D.Goby, J.N.Khouri, A.Durve, et al., Control of Protein A Column Loading During Continuous Antibody Production: A Technology Overview of Real-Time Titer Measurement Methods. Bioprocess International, 2019.

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