一种基于切向流过滤的脱辅基血红蛋白制备新方法
来自美国俄亥俄州立大学等的科学家们在2020年第117期的《Biotechnology and Bioengineering》杂志上发表了题为“Novel Manufacturing Method for Producing Apohemoglobin and its Biophysical Properties”的文章。文中，研究人员开发了一种新的、可放大的脱辅基血红蛋白（apoHb）生产方法，使用酸化乙醇溶液将疏水性血红素提取到溶液中，并通过切向流过滤将血红素从获得脱辅基蛋白中分离出来。结果显示，获得的总蛋白和活性蛋白产量分别为>95%和~75%，且apoHb制备液中残留的血红素<1%，SDS-PAGE分析显示纯度>99%。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
人血红蛋白（Hb）是人红细胞内的主要蛋白质成分，因其在氧气（O2）储存和运输中的作用而为人所知。在生理条件下，Hb以四聚体蛋白质（64kD）形式存在，有两对非共价结合的αβ二聚体（32kD）。在4个球蛋白链中（2α和2β球蛋白），一个血红素辅基紧密地绑定在疏水性血红素结合囊中。从Hb去除血红素而获得的脱辅基蛋白称为脱辅基血红蛋白（apoHb）。ApoHb可与血红素反应，形成重组的Hb（rHb），与天然的Hb相比，其生物物理性质几乎没有差异。apoHb的血红素结合能力以及血红素诱导的结构变化使其成为研究体内Hb合成和重组Hb生产的有趣前体。
在血红素模体缺失时，apoHb成为疏水性分子的递送载体。ApoHb两个空的血红素结合囊可结合疏水性分子，如修饰的血红素或治疗性药物分子。ApoHb的另一个特性是其可通过CD163+巨噬细胞或单核细胞而体内清除。这种体内摄入机制可能可用于将治疗性分子结合至apoHb，从而靶向递送至CD163+巨噬细胞和单核细胞。
一种用于活性apoHb生产的方法是丙酮提取法，操作时，Hb在-20℃条件下，加入酸化的丙酮，从而将血红素提取到溶液，并沉淀脱辅基蛋白（球蛋白）。固体蛋白沉淀从液相分离出来后，脱辅基蛋白质重溶于DI水中，再进行大量的透析，获得apoHb。另一种方法则利用酸化甲基乙基酮（MEK），在这种方法中，血红素的去除通过暴露于MEK，形成两个不混相的液体层。血红素分配进入有机层，而球蛋白分配进入水性层。液-液分离后，对水性球蛋白溶液进行透析，获得apoHb。但MEK和丙酮血红素提取工艺都需要使用高度易燃的溶剂，且在大规模条件下，需要成本高昂的分离设备并进行大量的透析操作。
切向流过滤（TFF）是一种基于粒径的过滤技术，由于其线性可放大性、经济性优势以及较长的膜使用寿命，而被生物技术行业广泛用于生物分子的纯化。此外，TFF可通过洗滤实现可控的缓冲液置换，相比费时费力的透析操作更受操作员青睐，且可降低apoHb生产设备的占地。在本研究中，使用TFF进行apoHb的生产，以80% 乙醇：水溶液（v/v）作为血红素提取溶剂。由于乙醇的闪点为20℃，而丙酮和MEK分别为-18℃和-3℃，所以相比此前使用的血红素提取溶剂，乙醇的使用降低了易燃性风险。在新的apoHb生产过程中，将水性Hb加入到酸性乙醇溶液中，使蛋白质部分解折叠，质子化球蛋白的近端组氨酸残基，使血红素与Hb的近端组氨酸断开。乙醇溶液溶解血红素，使溶液中同时存在游离血红素和游离球蛋白。之后，以酸性乙醇溶液连续洗滤，去除血红素，再以DI水和储存缓冲液连续洗滤，中和溶液，使蛋白质正确重折叠，生成apoHb。尽管血红素更容易从高铁血红蛋白（metHb、HbFe3+）提取，但将含氧亚铁Hb（oxy-Hb Fe2+）用作Hb前体，以避免对脱辅基蛋白潜在的氧化修饰或者与氧化剂使用相关的副反应导致的血红素与球蛋白的不可逆交联。此外，Hb加入到酸化EtOH溶液后，Hb迅速氧化成metHb。下图总结了活性apoHb的不同生产方法，包括新开发的TFF工艺。
用于从血红蛋白（Hb）生产活性apoHb的不同工艺。切向流工艺代表了一种新的活性apoHb生产方案（I.S.Pires, et al, 2020）。
实验操作
使用TFF制备apoHb
实验使用KrosFlo KR2i 切向流过滤系统和中空纤维过滤组件。从HB生产apoHb的工艺现在表面积20cm2的MicroKros TFF过滤器上进行，然后规模放大到表面积1050cm2的MiniKros TFF过滤器。在两种规模条件下，中空纤维均为聚砜材质，MWCO 10kD，内径0.5mm，长度20cm。纯化的oxy-Hb（低于5% metHb）添加到含有3 mM HCl的80%（v/v）EtOH/DI水混合液中，获得最高蛋白质浓度2mg/mL。对于使用MicroKros过滤器进行的实验，处理18 mg Hb，流速设置为25 mL/min。对于MiniKros过滤器实验，流速设置为1.1L/min，包括3个起始量为1g Hb的批次、3个1.2g Hb的批次以及8个2.0 g Hb的批次（以两根平行的HF组件运行）。跨膜压维持为7±1psi。Hb分散于酸性乙醇溶液后，系统以酸性乙醇连续洗滤9个体积。血红素去除后，无血红素的球蛋白以DI水洗滤5个体积，再以PBS洗滤5个体积。在MiniKros生产规模，进行最终浓缩步骤，将系统体积降低至最终总蛋白浓度40-115mg/mL。整个工艺在4±1℃的冷室内进行。每次运行后，TFF组件使用DI水彻底漂洗，再以0.1M NaOH 消毒，并保存在0.1M NaOH中。再次使用前，用DI水充分漂洗，以去除保存液。ApoHb TFF生产工艺下图所示。
apoHb TFF生产工艺。apoHb容器先充满酸性乙醇。Hb加入到溶液中，以酸性EtOH洗滤9个体积，再以DI水洗滤5个体积，PBS洗滤5个体积（I.S.Pires, et al, 2020）。
详细实验操作和分析方法，请参考原文。
结果
实验结果显示，获得的总蛋白和活性蛋白产量分别为>95%和~75%，且apoHb制备液中残留的血红素<1%，SDS-PAGE分析显示纯度>99%。在4℃、-80℃和冻干形式的长期储存中，几乎没有检测到apoHb活性的损失。从结构上看，体积排阻层析（SEC）和圆二色谱结果显示，apoHb为二聚体，与Hb相比，螺旋含量降低~25%。此外，质谱和反相色谱结果显示，α和β亚单位的质量与Hb中这些亚单位的理论质量基本一致，且未检测到从Hb中去除血红素导致的氧化修饰。SEC确认，apoHb可以与天然Hb相似的比例结合至亲血色蛋白。最后，重组的Hb（rHb）使用高铁血色原去除法处理，以分离功能性rHb，进行生物物理鉴定，结果显示，rHb的O2平衡曲线、O2解离以及CO缔合动力学与天然Hb一致。详细实验结果，请参考原文。
总结
ApoHb 的生物医学应用非常有前景，但其大规模使用和分析受限于当前生产方法的可放大性。尽管市面上已经有不少新的生物工艺技术，但是活性apoHb的生产方法多年来没有太大的变化。原文提出的酸性乙醇TFF apoHb生产方法可为生产活性apoHb提供一种简单、可放大的方案，总蛋白收率大于95%，总活性蛋白收率大于75%。相比之前的apoHb生产方法，通过使用80%（v/v）乙醇：水溶液进行血红素提取，可显著降低可燃性风险以及与残留溶剂相关的毒性问题。而本文方法最有价值的优势，是使用TFF这种简单、经济高效且可放大的工艺进行蛋白质的纯化。
与使用先前的方法制备的apoHb相比，TFF-apoHb具有相似的表征。这些表征包括：血红素-结合活性、Hp结合活性、在水性溶液中主要以二聚体形式存在、rHb O2平衡以及结合动力学特性。但是，与采用之前的方法生产的apoHb不同的是，稳定性研究显示，TFF-apoHb可在4℃、-80℃以及以冻干形式储存，且不显著改变其活性，相比此前的apoHb储存研究，室温条件下的稳定性更高。此外，TFF-apoHb的ESI-MS分析证实，其可保留结构特性，而无任何化学修饰。RP-HPLC证实，无论新鲜制备的TFF-apoHb还是冻干或于-80℃储存的样品，均无氧化修饰。通过SEC-HPLC进行的四级结构分析显示，TFF-apoHb以αβ二聚体形式存在，即使在4℃或22℃延长保存条件下，也不会出现显著量的四聚体。此外，根据在4或22℃延长储存条件下，apoHb β链的氧化作用，为apoHb氧化作用和降解提供了新的见解。最后，开发了一种优化的高铁血色原去除方法，可生产有别于天然Hb的rHb吸光度光度，而由TFF-apoHb获得的rHb证实，重组的蛋白质可维持天然Hb样 O2解离以及CO缔结动力学特性。
总结来说，本文提供了一种用于apoHb生产以及对apoHb和rHb相关生物物理特性进行综合性分析的新方法。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：I.S.Pires, D.A.Belcher, R.Hickey, et al., Novel Manufacturing Method for Producing Apohemoglobin and its Biophysical Properties. Biotechnology and Bioengineering, 2020, 117(1): 125-145.
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