使用Slope Spectroscopy® (斜率光谱法) 检测基因治疗产品中的质粒DNA纯度比
摘要
对于基因治疗中的质粒物料，使用260/280 UV吸光度比例，可对蛋白质存在条件下的DNA纯度进行评估。但是，当需要对DNA纯度进行准确定量时，该技术面临诸多挑战。SoloVPE及其斜率光谱技术为克服这些挑战提供了一种新方法，其可根据Beer-Lambert法则，准确检测DNA纯度比。
简介
基因治疗是遗传性疾病治疗的一个激动人心的新机会，它可能可为目前暂未得到满足的医疗需求提供一个使患者终生受益的解决方案。在该应用中，通过测试在260nm和280nm下的吸光度比例，检测DNA纯度。该比例也被称为R值。
几乎所有的传统分光光度计依赖于固定光程UV-Vis吸光度读数。使用这种方法会产生多个问题，特别是在处理质粒杂质时。质粒DNA（pDNA）中的常见杂质包括游离的核苷酸、单链核酸以及蛋白质。蛋白质由20种氨基酸组成；只有4种（色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸）在260nm处吸光，只有3种（色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）在280nm处吸光。R值会因为在260nm处吸光的4种氨基酸的丰度而有很大的差异。
同时，核酸的吸光度也取决于序列。尽管核酸在260nm和280nm处吸光，但在每种波长下的吸光量并不相同，其结果是，不同的序列会有不同的消光系数和R值。
本应用笔记证实，SoloVPE具有准确测量质粒内R值的能力。斜率光谱法解决了用户样品体积和稀释以及不一致的波长读数的挑战，使仪器能够基于软件内的特定参数，提供可靠的数据。除了所有这些挑战，SoloVPE可使用户能够快速、精确地测量可变光程下的吸光度读数。
设备/仪器
SoloVPE 设备，C Technologies，IN-VPE-SOLO5
Cary 60，Agilent，IN-CARY60
ConfiRM 标准品，1.999 abs/mm，C Technologies，目录号 MRM-PFI08-01-P10（定制）
ConfiRM 标准品，4.975 abs/mm，C Technologies，目录号 MRM-PFI08-02-P10（定制）
ConfiRM 标准品，23 Abs/mm，C Technologies，目录号 MRM-01-P1
胰岛素，Sigma，目录号 I0516-5ML
质粒pCI-neo，项目编码2019-1888，批号 MB2017459，Lake Pharma
SoloVPE光纤 OF0002-P50
塑料样品瓶 OC0009-1-P50
方法 & 结果
如比例在1.8和2.0之间，R值通常可接受为“纯”的。ConfiRM标准品用于有效证实该接受标准。分析开始时，每个标准品在272nm处重复检测三次。
用水稀释制备1.0 mg/mL pCl-neo DNA质粒和1.0 mg/mL 牛血清胰岛素蛋白原液。从200nm到360nm对原液进行光谱扫描。吸光度曲线下图所示。
图1. pCLS24044质粒和牛胰岛素蛋白UV曲线
使用SoloVPE确认原液浓度为1.0 mg/mL，完成系统适用性测试。
使用的消光系数如下：
确认原液为1.0 mg/mL之后，确定从100%质粒到100%蛋白质的25个纯度水平。如表1所示。
表1. 纯度比例水平
每个纯度水平使用SoloVPE分析。在260nm和280nm处获取3个重复斜率测量值，取平均值后，作为单个报告斜率值。使用斜率比例，计算每个水平的R值。
分析
获得的纯度比对应其纯度百分比作图。在每个水平上获得的纯度比与理论比曲线良好吻合。SoloVPE软件同时提供260nm和280nm处斜率，并使用User Result（用户结果）功能自动计算比例。
表2. 纯度比准确性
计算纯度比例，确定每个水平的理论比例。由于蛋白质和DNA吸光度无干扰，结合两种发色团的吸光度可相加，并使用以下公式进行计算：
φ表示体积分率
j表示成分（即DNA或蛋白质）
i表示波长（即260或280nm）
理论和检测的R值和误差百分比如表2所示。获得25个纯度比例中，相比理论的最大检测误差为1.56%，平均检测误差为0.25%。这些结果证实，在不同纯度比例下，检测具有良好的准确性和可重复性，所有25个纯度比例额偏差小于2%。
总结
目前的看法是，用UV 260/280的比例来确定纯度是没有用的，因为正交试验所依赖的灵敏度更高。经过一致的观察，如果纯度比例值超过1%的典型变化，则表明杂质含量在15%左右。对于1.0 mg/mL的质粒样品，这表明蛋白质杂质的含量150 μg/mL，仅仅略高于比色法的灵敏度。
相比传统分光光度计，SoloVPE可显著提高灵敏度。SoloVPE及其专用软件允许在260nm和280nm处同时检测，结果自动报告。用于确定质粒DNA纯度比的SoloVPE UV光谱法已被证实是一种重要的分析工具，可加快极具挑战性的样品的检测，提供即时的反馈，并为满足医疗需求开辟了多种可能性。SoloVPE作为快速、可重复且更准确的检测方法，已在单抗等行业中得到了广泛应用，是GMP生产中的标准检测技术之一。
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Repligen收购C Technologies
SoloVPE 工作原理
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