导 读

腺相关病毒（AAV）是目前体内递送最常用的载体，对在体基因编辑治疗至关重要。基于Cas9的编辑器由于体积过大，难以通过单个AAV来递送。Cas9蛋白的祖先IscB蛋白大小仅有Cas9的2/5，因此在递送方面极具优势。然而，IscB在人类细胞中极低的编辑效率难以满足应用需求，因此如何提高IscB的编辑效率对临床应用具有非常重要的意义。

图1 图文摘要

CRISPR-Cas9系统是目前最广泛使用的基因组编辑技术，它极大地推动了生物医学研究。Cas9与其他效应蛋白的融合产生了碱基编辑器、引物编辑器和表观编辑器，满足了多功能应用的需求。然而，Cas9介导的双链DNA切割可能存在染色体重排风险，而基于Cas9和脱氨酶或糖苷酶组成的碱基编辑器的编辑方式由于不依赖双链DNA断链，因而在应用上更为安全。但是，由于Cas9蛋白的尺寸较大，基于Cas9的碱基编辑器往往超过了单个AAV的包装极限，因此开发更小型的编辑器对基因编辑技术的在体应用具有重要意义。Cas9的祖先蛋白IscB具有跟Cas9相似的功能，体积却只有Cas9的2/5左右，原则上更易于AAV的装载。然而，IscB在动物细胞中极低的编辑效率难以满足基因编辑应用的需求，因此提高IscB的编辑效率至关重要。

为了使IscB产生跟Cas9相当的编辑活性，我们团队对IscB和它的引导序列(ωRNA)进行了系统性的工程化改造（图1），该研究成果最近发表在Nature Methods杂志上。在这项研究中，我们成功开发了活性增强的IscB变体(enIscB)以及AAV兼容大小的微型碱基编辑器。首先使用一种非常灵敏便捷的三荧光报告系统来检测IscB的靶向切割活性，发现野生型IscB在该报告系统中可以检测到20%的EGFP阳性细胞。我们根据二级结构对ωRNA进行了大量优化，包括截短茎环区并用C-G碱基对取代A-U碱基对以增强ωRNA的稳定性。经过多轮筛选，获得了一种编辑效率提高约120%的最佳ωRNA变体，并将其命名为ωRNA*。此外，为了提高蛋白和靶序列的亲和力，我们通过将每个氨基酸突变为带正电荷的精氨酸，筛选了数百种IscB变体。经过多轮筛选，确定了一种具有与Cas9相当活性的增强型IscB变体，并将其命名为IscB*。我们通过组合IscB*和ωRNA*获得了编辑效率最高的enIscB系统。

考虑到IscB的切割产物具有5'-粘性末端，我们将enIscB与核酸外切酶T5E（enIscB-T5E）融合以消化5'-粘性末端。我们发现enIscB-T5E系统比enIscB系统具有更高的切割效率。更重要的是，enIscB-T5E系统的染色体易位风险较低，因此更安全。

我们将enIscB的切口酶变体与胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶融合后分别得到具有高效活性的碱基编辑器miCBE和miABE，均可以支持高达90%的高碱基转化率。对miCBE和miABE的进一步评估发现，其碱基编辑窗口比Cas9衍生的碱基编辑器的编辑窗口更宽，这可能会在未来的工程优化中得到改善。通过系统的脱靶检测实验和分析，包括引导相关和引导无关的方法，我们发现miABE和miCBE的特异性与Cas9相当。总的来说，我们目前的工作为生物医学领域不同应用场景中使用的工程微型基础编辑器或引物编辑器和表观编辑器打开了大门。

总结与展望

IscB在基于AAV递送的基因编辑领域具有足够明显的优势，使其未来在体内能够通过低剂量AAV递送便可实现高效的基因组编辑。然而要使IscB成为基因治疗应用中更受欢迎和更安全的工具，还需要更多的深入探索，例如扩展TAM序列、缩小碱基编辑窗口以及提高特异性等。鉴于IscB的尺寸优势，它有潜力用于开发基于单一AAV递送的DNA甲基化编辑器和引物编辑器。筛选天然IscB蛋白变体和通过人工突变获得更多的IscB变体将是扩展IscB功能的两个重要途径。

责任编辑

周  转   得克萨斯大学西南医学中心

杨  莹   中国科学院北京基因组研究所

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原文链接：http://www.the-innovation.org/life/article/10.59717/j.xinn-life.2023.100008

本文内容来自The Innovation姊妹刊The Innovation Life第1卷第1期以Perspective发表的“Miniature genome editors derived from engineering Cas9 ancestor” (投稿: 2023-06-03；接收: 2023-06-12；在线刊出: 2023-06-19)。

DOI: https://doi.org/10.59717/j.xinn-life.2023.100008

引用格式：Zhou Y. and Xu C. (2023). Miniature genome editors derived from engineering Cas9 ancestor. The Innovation Life 1(1), 100008.

作者简介

周英思，博士，辉大基因创新研究院执行院长。主要从事基因编辑技术开发和基因编辑治疗应用研究。以通讯作者和第一作者(含共同)在Nature Methods，Nature Genetics，Nature Communications，Protein & Cells等杂志上发表研究论文10余篇。

胥春龙，博士，临港实验室/上海脑科学与类脑研究中心研究员。专注基因编辑与疾病研究。目前在Nature Methods, Nature Biotechnol., Science Trans. Med., J Clin Invest., Genome Biol., PNAS等期刊发表论文17篇，研究成果取得了具有自主知识产权专利2项，受到国内外同行高度关注，曾获得国自然、上海启明星计划等资助。

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