导 读

炎症反应是机体应对异物入侵常见的生理、病理性活动。其中，炎症小体发挥着重要的作用，而NLRP3（NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3）是其中的一种关键作用蛋白。NLRP3的超活化在病毒和细菌感染过程中起着重要的作用，然而NLRP3超活化的机制尚不清楚。此外，针对NLRP3在炎症反应中激活和调控的机制研究，对于相关靶向药物的研发具有重要的意义。本研究通过CRISPR/Cas9技术筛选可调控NLRP3超活化的基因，揭示了NLRP3炎症小体在超活化状态下精细调控的分子机制，对未来临床治疗感染性疾病有所助益。

图1  AA467197在慢性感染中对NLRP3炎症小体超活化状态的调控机制

炎症小体是一种较大的多聚体蛋白复合物，主要存在于攻击病原体的先天免疫细胞中，它在响应外源性病原体或内源性危险信号时会引发炎症反应。炎症小体复合物主要由传感器（NLR或ALR家族的成员），衔接蛋白ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，凋亡相关斑点样蛋白)和效应蛋白procaspase-1组成。炎症小体在受到多种信号刺激后引起caspase-1（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）激活、GSDMD（Gasdermin D）切割和IL-1β（白细胞介素-1β）分泌，此过程在病毒和细菌感染中发挥重要作用。炎症小体可以分为NOD样受体和双链DNA传感器AIM2受体。在NOD样受体中，NLRP3在髓系细胞中广泛表达，并有助于免疫系统的抗感染反应。经典的NLRP3炎症小体激活途径介导GSDMD切割，导致细胞焦亡，有利于在感染的早期阶段限制病原体的扩增。然而，在GSDMD切割受到限制的感染过程中，NLRP3炎症小体会发生超活化，诱导IL-1β的持续分泌，同时保持细胞存活。

抗病原体感染分子的筛选

在该研究中，研究人员以CRISPR/Cas9技术为基础，用少量病原体感染永生化骨髓来源的巨噬（iBMDM）细胞，刺激NLRP3的超活化状态发生，挑选具有严重毒性的细胞进行测序及GO富集分析。研究结果显示，在甲型流感病毒Flu感染组中（图2A），最显著的生物学功能与细胞因子的产生、蛋白质分泌和炎症反应有关（图2B）。在肺炎克雷伯菌K.p感染组中（图2C），参与细菌感染应答、细胞因子产生和分泌的生物学功能被富集（图2D）。在金黄色葡萄球菌S.a感染组（图2E），最重要的生物学功能是关于细胞因子的产生、T细胞的激活和对细菌感染的反应（图2F）。然后分析这三组中都存在的4个基因AA467197、Nlrp3、Nlrp1a和Trem2（图2G）。鉴于AA467197在炎症中的作用尚不明确，进一步分析其功能。构建AA467197缺陷的iBMDM细胞并进行刺激，研究人员观察到AA467197缺失导致细胞活力下降，死亡率升高（图2H和2I）。最后，AA467197被鉴定为低剂量感染免疫应答的重要调节因子。

图2 利用CRISPR-sgRNA筛选抗感染分子

AA467197抑制NLRP3炎症小体超活化

为了研究AA467197在NLRP3炎症小体激活中的作用，研究人员对从AA467197^-/-小鼠中提取的原代BMDM细胞进行刺激，发现在AA467197^-/-细胞中，caspase-1的激活和IL-1β的成熟不受影响（图3A），NLRP3的过度活化并没有导致细胞死亡（图3D）。然而，AA467197^-/-细胞在NLRP3超活化诱导后发生了焦亡（图3D）。研究人员将WT（野生型）和AA467197^-/-BMDM细胞与少量Flu孵育，发现AA467197^-/-细胞在病毒感染后表现出严重的细胞毒性（图3E）。此外，在K.p感染组（图3F）和S.a感染组中也观察到了类似的结果（图3G）。这些结果表明，AA467197在低剂量感染期间是NLRP3炎症小体超活化所必需的。

图3 AA467197抑制NLRP3炎症小体超活化

AA467197与GSDMD结合

为了探究AA467197如何参与NLRP3的超活化，研究人员利用酵母双杂交系统筛选了小鼠骨髓cDNA文库，检测到GSDMD片段（图4A）。通过免疫共沉淀及pulldown实验，在HEK293T细胞中进一步验证了AA467197和GSDMD之间的关联（图4B-C）。此外，在PGN刺激的原代BMDM细胞中观察到AA467197和GSDMD之间的相互作用（图4D），推测AA467197阻碍了caspase-1对GSDMD的加工。因此，作者进一步检测了caspase-1和GSDMD之间的关系，发现当细胞被低剂量的病毒感染处理时，caspase-1和GSDMD之间的相关性大大增强（图4F），在低剂量的K.p（图4G）和S.a感染刺激的细胞中也观察到了类似的结果（图4H）。这些研究结果表明，AA467197与GSDMD结合，正向调节了NLRP3的超活化。

图4 AA467197与GSDMD结合

AA467197缺失加剧了宿主对病原体的防御

进一步研究AA467197和GSDMD之间的结合是否阻碍GSDMD的加工，研究人员发现在PGN刺激后，AA467197^-/-BMDM细胞中有更多的GSDMD切割（图5A），并发现GSDMD突变后AA467197^-/-BMDM细胞活力恢复（图5B和5C）。随后用少量的Flu感染 WT和AA467197^-/-小鼠，发现AA467197^-/-小鼠比WT小鼠更易感染（图5D和5E）。同样，在感染K.p和S.a的WT和AA467197^-/-小鼠中也检测到类似的结果（图5F-5I）。这表明AA467197的缺失加剧了宿主在体内对病原体的防御。

图5  AA467197缺失加剧了宿主对病原体的防御

总结与展望

NLRP3炎症小体在病毒和细菌感染过程中起着至关重要的作用。急性感染导致NLRP3炎症小体的立即激活，激活的caspase-1切割GSDMD，诱导感染细胞的焦亡，限制病原体的增殖和传播。然而，在低剂量感染期间，细胞焦亡被抑制，炎症因子的分泌长时间持续，导致NLRP3炎症小体的超活化。本研究揭示了AA467197参与NLRP3超活化的调控，即AA467197与GSDMD结合，抑制caspase-1对GSDMD加工，导致细胞膜上形成有限的膜孔，这些膜孔可正常分泌IL-1β，同时保持细胞存活。总之，本研究确定了AA467197在NLRP3超活化的过程中发挥的重要作用。该研究或可为未来NLRP3炎症小体激活相关疾病的治疗提供新思路。

责任编辑

赵柏林   西安交通大学

罗荣灿   中国科学院昆明动物研究所

扫二维码｜查看原文

原文链接：https://www.the-innovation.org/article/doi/10.59717/j.xinn-life.2023.100012

本文内容来自The Innovation姊妹刊The Innovation Life第1卷第1期以Report发表的“AA467197 controls the hyperactivation of the NLRP3 inflammasome during infection” (投稿: 2023-03-12；接收: 2023-05-10；在线刊出: 2023-05-28)。

DOI: https://doi.org/10.59717/j.xinn-life.2023.100012

引用格式：Liu Q., Li W., Qian Y., et al. (2023). AA467197 controls the hyperactivation of the NLRP3 inflammasome during infection. The Innovation Life 1(1), 100012.

作者简介

夏朋延 ，博士，北京大学基础医学院免疫系研究员，国家优秀青年基金获得者，主要从事于发现新的模式识别受体、鉴定新的特征性病原分子，探索NLRP3炎症小体的活化机制及其在肠炎、皮肤性炎症中的作用。相关研究成果在Nat Immunol、Immunity、Cell Host Microbe、Cell Mol Immunol、Nat Commun以及EMBO J等学术期刊发表。

往期推荐

The Innovation 简介

扫二维码 ｜ 关注期刊官微

The Innovation是一本由青年科学家与Cell Press于2020年共同创办的综合性英文学术期刊：向科学界展示鼓舞人心的跨学科发现，鼓励研究人员专注于科学的本质和自由探索的初心。作者来自全球54个国家；已被126个国家作者引用；每期1/5-1/3通讯作者来自海外。目前有196位编委会成员，来自21个国家；50%编委来自海外；包含1位诺贝尔奖获得者，37位各国院士；领域覆盖全部自然科学。The Innovation已被DOAJ，ADS，Scopus，PubMed，ESCI，INSPEC，EI等数据库收录。2022年影响因子为32.1，CiteScore为23.6。秉承“好文章，多宣传”理念，The Innovation在海内外各平台推广作者文章。

期刊官网：

www.the-innovation.org

www.cell.com/the-innovation

期刊投稿（Submission）：

www.editorialmanager.com/the-innovation

商务合作（Marketing）：

marketing@the-innovation.org

Logo｜期刊标识

See the unseen & change the unchanged

创新是一扇门，我们探索未知；  

创新是一道光，我们脑洞大开；  

创新是一本书，我们期待惊喜；  

创新是一个“1”，我们一路同行。

The Innovation 姊妹刊

The Innovation