导 读

数量庞大的细菌在自然环境中共存，并争夺有限的资源。同时，它们还展现出高度的社会化行为，利用化学信号与生态系统中的其他生物体进行交流、合作或竞争。破译细菌通过小分子化合物控制种间相互作用的分子机制，对于了解它们如何影响环境或宿主非常重要。本文揭示了细菌Enterobacter sp. CGMCC 5087通过顺序合成次级代谢产物控制种间竞争与合作的分子机制，为该菌株在农业生产中的应用提供理论基础。

图1 Enterobacter sp. CGMCC 5087通过2-PE和IAA协调种间竞争和合作的机制

土壤细菌和植物之间联系紧密，可以通过与其它微生物或植物相互作用影响植物的发育和健康。一些有益微生物通过产生抗菌化合物，如挥发性化合物苯乙醇（2-Phenylethanol，2-PE），抑制植物致病细菌和真菌的生长，发挥植物保护作用。另一方面，有些微生物还可以合成植物生长激素，如吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），刺激植物生长，从而建立起有益的植物-微生物相互作用。其中，2-PE和IAA均可通过扩展的莽草酸途径，分别利用苯丙酮酸脱羧酶（PPDC）和吲哚丙酮酸脱羧酶（IPDC）等α-酮酸脱羧酶进行合成（图2A）。研究人员在细菌Enterobacter sp. CGMCC 5087中鉴定了一种α-酮酸脱羧酶KDC4427，其可以与醇脱氢酶ADH4428一起合成2-PE。α-酮酸脱羧酶通常具有宽泛的底物谱，一些α-酮酸脱羧酶在体外同时表现出PPDC和IPDC活性，但在体内是否由同一α-酮酸脱羧酶产生2-PE和IAA在很大程度上是未知的。此外，尽管已有研究分别阐释了它们的合成及调控机制，但其合成和调控的相关性以及对生物行为和生态功能的潜在作用仍有待阐明。

细菌顺序合成2-PE和IAA，并依赖于KDC4427

在本研究中，研究人员通过基因敲除与体外酶活实验证明了KDC4427是一种具有PPDC和IPDC活性的双功能酶，并在肠杆菌Enterobacter sp. CGMCC 5087合成2-PE和IAA中发挥重要作用（图2C,D）。考虑到KDC4427对2-PE和IAA的合成都是必不可少的，因此，研究人员进一步探究了2-PE和IAA的合成模式。结果表明，无论是在富营养培养基中还是在限制性培养基中，2-PE的合成都以对数期为主；IAA则主要在进入稳定期时合成，并且只有在富含色氨酸的环境下才大量合成（图2C-F）。此外，体外酶活检测表明，KDC4427催化苯丙酮酸脱羧的速度更快，而对吲哚-3-丙酮酸表现出更高的亲和力，这表明它可能根据底物的浓度和酶的量来决定反应的方向。这些结果表明，KDC4427基因在Enterobacter sp. CGMCC 5087合成 2-PE和IAA中起关键作用，且2-PE和IAA依次在对数生长期和稳定期合成。

        图2 细菌顺序合成2-PE和IAA，并依赖于KDC4427

KDC4427和ADH4428在不同生长阶段的表达模式不同，且与2-PE和IAA的合成相关

为了研究细菌如何协调KDC4427的不同功能，研究人员分析了KDC4427在基因组中的位置和基因排列。分析显示，KDC4427与下游基因ADH4428 （编码一种假定的L-甘油醛3-磷酸还原酶，可与KDC4427合成2-PE）以185 bp的间隔序列头对头排列（图2B和图3A）。实验表明该185 bp序列为双向启动（P_4427-4428），KDC4427的表达需要全长的启动子序列（包含浅蓝色和绿色两个启动子区域）（图3A-C），而ADH4428的表达仅需包含绿色启动子区域即可（图3A,B,D）。进一步研究显示，KDC4427 在菌株生长进入稳定期时表达较高（图3E），而ADH4428主要在对数生长期表达（图3F）。此外，研究显示KDC4427的表达受到苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）的诱导（图3G），而ADH4428的表达受到2-PE的抑制（图3H）。这些结果表明2-PE和IAA的合成模式与KDC4427和ADH4428的表达模式有关。

图3 KDC4427和ADH4428的表达模式

芳香族氨基酸代谢调控因子TyrR和sigma因子RpoS结合KDC4427-ADH4428启动子并调控其基因表达

为了探索KDC4427和ADH4428的潜在调控机制，研究人员通过DNA pull-down、蛋白质组分析与EMSA实验鉴定了其调控蛋白TyrR与RpoS，两者均特异性结合KDC4427和ADH4428的启动子（图4A,B）。作者进一步研究了TyrR及RpoS对KDC4427和ADH4428基因表达的调控作用，结果显示在对数生长期和稳定期，TyrR和RpoS均正调控KDC4427的表达（图4C,D），而负调控ADH4428的表达（图4E,F）。

图4 TyrR和RpoS结合KDC4427-ADH4428启动子并调控基因表达

TyrR和RpoS正调控2-PE和IAA的生产

为了检测TyrR和RpoS在2-PE和IAA生产中的功能，研究人员检测了ΔtyrR突变体中2-PE和IAA的含量。发现ΔtyrR中2-PE的产量在4 h和12 h时分别比WT下降38%和68%， IAA的产量在4 h时比WT下降40%，其他时间点下降~95%（图5A,B）。在ΔrpoS突变体中也观察到类似的结果（图5C,D）。这些结果表明TyrR和RpoS对Enterobacter sp. CGMCC 5087中2-PE和IAA的合成有显著的促进作用。

图5 TyrR和RpoS正调控2-PE和IAA的合成

2-PE和IAA的时序合成有利于种间竞争与合作

为了探究Enterobacter sp. CGMCC 5087时序合成2-PE和IAA的生物学效应。研究人员测试了2-PE对来自不同栖息地的革兰氏阴性（G-）和阳性（G+）细菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。结果显示，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）对2-PE的敏感性高于Enterobacter sp. CGMCC5087（图6A），说明Enterobacter sp. CGMCC5087与这三种菌株共存时可能具有竞争优势。竞争性实验表明，Enterobacter sp. CGMCC 5087对大肠杆菌的抑制作用部分依赖于2-PE（图6B,C）。此外，Enterobacter sp. CGMCC 5087也可依靠2-PE抑制植物病原真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的生长 (图5D,E)。为了确定该菌株是否通过合成的IAA促进植物根系生长，研究人员检测了菌株分泌产物对水稻幼苗根系生长的影响。结果表明，野生型菌株（WT）的分泌产物可以明显促进水稻根的伸长（图5F,G）。此外，水稻幼苗根分泌物还可以促进Enterobacter sp. CGMCC 5087的生长（图5H）。2-PE和IAA的合成模式和生物学效应表明，2-PE和IAA的顺序生产可能有助于Enterobacter sp. CGMCC 5087在早期抑制潜在竞争对手的生长，在后期促进植物生长，从而更好地适应不断变化的环境。

图6 2-PE和IAA的顺序生产有利于种间竞争与合作

总结与展望

细菌通过产生种类繁多的次生代谢物，与其它物种以拮抗或互惠的方式相互作用，以提高在复杂和高度竞争的生态系统中的生存能力。而细菌协调竞争和合作以适应不同的生长阶段和不断变化的环境，对其生存至关重要。本研究揭示了Enterobacter sp. CGMCC5087通过调控同一操纵子中基因的时序表达，在对数期合成2-PE以抑制竞争者；在稳定期合成IAA以促进植物生长，形成互惠关系。这些结果揭示了细菌通过调控2-PE和IAA的顺序合成，巧妙地控制竞争和合作行为以适应生长和环境条件。该研究表明菌株Enterobacter sp. CGMCC5087在农业生产中具有潜在应用前景。

责任编辑

林昶东   同济大学

王香明   中国科学院生物物理研究所

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原文链接：https://www.the-innovation.org/article/doi/10.59717/j.xinn-life.2023.100023

本文内容来自The Innovation姊妹刊The Innovation Life第1卷第2期以Article发表的“Sequential production of secondary metabolites by one operon affects interspecies interactions in Enterobacter sp. CGMCC 5087” (投稿: 2023-05-23；接收: 2023-08-27；在线刊出: 2023-08-29)。

DOI: https://doi.org/10.59717/j.xinn-life.2023.100023

引用格式：Liu L., Chen G., Liu J.,  et al. (2023). Sequential production of secondary metabolites by one operon affects interspecies interactions in Enterobacter sp. CGMCC 5087. The Innovation Life 1(2), 100023.

作者简介

张丽华，博士，研究员。2000年于中国科学院大连化学物理研究所获博士学位，师从张玉奎院士；1999年10月至2003年3月先后在德国和日本从事合作研究。2003年4月至今在大连化物所工作。现任生物分子高效分离与表征研究组组长，中科院分离分析化学重点实验室副主任。主要从事蛋白质组学定性定量和相互作用分析新技术新方法研究，在Nat. Commun., Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Mater., Hepatology, Sci. China Chem., Anal. Chem.等期刊发表 SCI 论文280余篇；获授权发明专利100余项。承担科技部重点研发计划项目、基金委重大研究计划重点支持项目和国家杰出青年基金等。入选中国科学院人才引进计划、科技部中青年科技创新领军人才和中组部万人计划；获国家自然科学二等奖（排名第二）、中国青年女科学家奖和中国青年科技奖等奖项。

张海波，博士，中国科学院青岛生物能源与过程所研究员，系统微生物工程研究组负责人。2010年毕业于山东大学微生物技术国家重点实验室，获博士学位。研究领域为微生物学和代谢工程，在国际权威杂志Nat. Commun.等刊物上发表论文80余篇，申请国家发明专利50余项。获得青促会优秀会员（2021）、山东省杰出青年基金（2020）、中国工程院-中国石化协会“闵恩泽”能源化工青年进步奖（2017）等荣誉称号。

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